Western blot là một kỹ thuật phát hiện một loại protein cụ thể từ một mẫu protein. Kỹ thuật này được thực hiện thông qua một số bước chính: điện di gel, làm mờ và lai. Điện di gel natri dodecyl sulfate polyacrylamide [Trang SDS] là một loại kỹ thuật điện di gel được sử dụng để tách protein theo kích thước của chúng [trọng lượng phân tử]. Western blot là một tấm đặc biệt của màng thấm được sử dụng để chuyển cùng một kiểu protein trong Trang SDS. Sự khác biệt chính giữa Trang SDS và Western blot là Trang SDS cho phép tách protein trong hỗn hợp trong khi Western blot cho phép phát hiện và định lượng một loại protein cụ thể từ hỗn hợp. Cả hai đều hữu ích trong nghiên cứu phân tích protein.
NỘI DUNG1. Tổng quan và sự khác biệt chính2. Trang SDS là gì3. Western Blot là gì4. So sánh cạnh nhau - Trang SDS vs Western Blot
5. Tóm tắt
Trang SDS là gì?
Trang SDS là một kỹ thuật điện di gel được sử dụng để tách protein. Nó thường được sử dụng trong hóa sinh, di truyền, pháp y và sinh học phân tử. Khi các protein được chiết xuất từ mẫu, chúng được chạy trên một loại gel được tạo thành từ SDS và polyacrylamide. SDS là một chất tẩy anion được sử dụng để tuyến tính hóa protein [protein biến tính] và truyền điện tích âm cho protein tuyến tính tỷ lệ thuận với khối lượng phân tử của chúng. Polyacrylamide trở thành hỗ trợ vững chắc cho gel. Các protein bị biến tính được tích điện âm di chuyển về phía cực dương của thiết bị thông qua gel. Theo kích thước của protein, tốc độ di chuyển khác nhau giữa các protein và xảy ra sự phân tách. Do đó, trang SDS rất hữu ích cho việc tách các protein riêng lẻ dựa trên kích thước của chúng.
Việc chuẩn bị gel polyacrylamide để phân đoạn protein là một bước quan trọng trong Trang SDS. Nồng độ chính xác của polyacrylamide và loại tác nhân liên kết ngang được sử dụng ảnh hưởng mạnh đến các tính chất vật lý của gel, tạo ra sự phân tách thực tế của các protein khác nhau. Các kích thước lỗ của gel nên được quản lý đúng cách để phân tách hiệu quả. Tuy nhiên, Trang SDS được coi là một kỹ thuật tách protein có độ phân giải cao.
Kỹ thuật SDS Page có một hạn chế lớn trong phân tích protein. Do SDS làm biến tính protein trước khi tách, nó không cho phép phát hiện hoạt động của enzyme, tương tác liên kết với protein, đồng yếu tố protein, v.v..
Hình 01: Trang SDS
Tây phương là gì?
Kỹ thuật làm mờ phương Tây cho phép phát hiện một loại protein cụ thể từ hỗn hợp protein và đo lường số lượng và trọng lượng phân tử của protein. Western blot là màng được sử dụng trong quy trình làm mờ để có được hình ảnh phản chiếu của các mẫu protein trong gel SDS- polyacrylamide. Màng được sử dụng để làm mờ vết rạn da phương Tây hầu hết được tạo thành từ nitrocellulose hoặc polyvinylidene Difluoride [PVDF]. Màng có protein được chuyển có thể được sử dụng để xác định protein mong muốn. Nó đòi hỏi kháng thể chất lượng cao để phát hiện protein mong muốn bằng cách lai. Kháng thể liên kết với kháng nguyên cụ thể của nó và cho thấy sự hiện diện của kháng nguyên mong muốn là protein.
Việc chuyển các protein từ gel polyacrylamide SDS sang blot phía tây được thực hiện bằng phương pháp đốt điện. Đây là một phương pháp hiệu quả và nhanh chóng, làm cho các protein điện di ra khỏi gel và truyền vào màng nitrocellulose [Western blot].
Hình 02: Western Blot
Sự khác biệt giữa Trang SDS và Western Blot là gì?
| Trang SDS là một kỹ thuật điện di gel. | Western blot là một kỹ thuật được thực hiện trên màng để phát hiện một loại protein cụ thể từ hỗn hợp. |
| Sử dụng | |
| Trang SDS cho phép tách protein theo kích thước của chúng. | Western blot cho phép chuyển protein trên gel trang SDS mà không thay đổi kiểu mẫu của nó & cho phép lai với các kháng thể cụ thể. |
| Nhược điểm | |
| Biến tính protein, chi phí cao và sự hiện diện của hóa chất độc tố thần kinh là những nhược điểm của kỹ thuật này. | Kỹ thuật này tốn nhiều thời gian và đòi hỏi một điều kiện cá nhân và kiểm soát cụ thể có kinh nghiệm. |
Tóm tắt - Trang SDS vs Western Blot
Trang SDS và Western blot là hai phương pháp liên quan đến phân tích protein. Trang SDS cho phép dễ dàng tách protein trên gel theo trọng lượng phân tử của chúng. Western blot giúp xác nhận sự hiện diện và số lượng của một loại protein cụ thể thông qua quá trình lai với các kháng thể cụ thể. Đây là sự khác biệt giữa Trang SDS và Western blot.
Người giới thiệu:1. Blancher, C. và A. Jones. Thanh SDS -PAGE và Kỹ thuật làm mờ phương Tây. Các phương pháp trong y học phân tử. Thư viện Y khoa Quốc gia Hoa Kỳ, n.d. Web. 27 tháng 3 năm 2017
2. Nowakowski, Andrew B., William J. Wobig và David H. Petering. Cấm bản địa SDS-TRANG: Phân tách protein điện phân độ phân giải cao với việc giữ lại các thuộc tính bản địa bao gồm các ion kim loại ràng buộc. Metalomics: tích hợp khoa học sinh trắc học. Thư viện Y khoa Quốc gia Hoa Kỳ, tháng 5 năm 2014. Web. 27 tháng 3 năm 2017.
Hình ảnh lịch sự:1. Điện di SDS-PAGE Điện di 'Bensaccount tại Wikipedia tiếng Anh [CC BY 3.0] qua Commons Wikimedia
2. miền Tây blot 114A Xuất bởi Amanthabagdon - Công việc riêng [Miền công cộng] qua Commons Wikimedia
Western Blot là một kỹ thuật phân tích được sử dụng rộng rãi nhằm phát hiện các protein chuyên biệt trên các mẫu mô hay dịch chiết xuất mô.
Bạn đang đọc: Western blot là gì
Phương pháp này sử dụng điện di trên gel để phân tách các protein còn nguyên vẹn bằng cấu trúc 3D hay protein đã biến tính theo độ dài của mạch polypeptide. Protein này sau đó sẽ được chuyển lên màng [thường sử dụng là màng nitrocellulose hay màng PVDF], ở đó chúng được gắn bằng các kháng thể đặc hiệu với protein mục tiêu. Điện di trên gel sẽ được đưa vào hệ thống phân tích Western Blot nhằm giải quyết các vấn đề của các phản ứng chéo giữa các kháng thể.
Nguồn ảnh: //proteomics.case.edu/proteomics/westernblot.html
1. Nguyên lý
Western Blot là kỹ thuật lai giữa protein với protein [Kháng nguyên – Kháng thể]. Protein kháng nguyên được phát hiện qua phản ứng tạo màu hoặc phát huỳnh quang
2. Các bước thực hiện:
Bước 1: Xử lý mẫu
Lấy mẫu từ toàn bộ mô hay môi trường nuôi cấy tế bào. Đầu tiên, xử lý mô rắn bằng phương pháp cơ học sử dụng máy nghiền, sử dụng máy đồng hóa hoặc siêu âm. Những mẫu virus hay mẫu lấy trừ trong môi trường nuôi cấy cũng có thể là nguồn protein xác định được trong Western Blot. Thêm các loại chất tẩy rửa, muối và dung dịch đệm để ly giải tế bào và hòa tan protein
Bước 2: Điện di trên gel
Điện di trên gel để phân tách các protein trong mẫu. Sự phân tách này của protein dựa trên điểm đẳng điện, khối lượng phân tử, điện tích hoặc phối hợp các yếu tố trên.
Phương pháp điện di phổ biến nhất là điện di trên gel polyacrylamide và có bổ sung sodium dodecyl sulfate [SDS]. Phương pháp SDS – PAGE [điện di trên gel polyacrylamide và có bổ sung SDS] giữ các polypeptide ở trạng thái biến tính sau khi chúng được xử lý với chất khử mạnh và mất đi cấu trúc bậc 2, cấu trúc bậc 3.
Các mẫu được nạp vào trong các giếng của bản gel. Thường để lại một giếng cho chỉ thị [marker] hoặc thang chuẩn ladder, là một sản phẩm thương mại có chứa hỗn hợp các protein với khối lượng phân tử xác định được nhuộm để có thể tạo ra band màu và nhìn thấy được. Khi điện thế được thiết lập trên gel, protein bắt đầu di chuyển với tốc độ khác nhau phụ thuộc vào khối lượng phân tử của chúng. Vận tốc khác nhau của các protein [sự khác biệt về độ di động điện di] sẽ tạo thành vạch khác nhau trên mỗi giếng.
Xem thêm: You Can Now 'Rick Roll' Your Zoom Meetings, Rick Astley
Bước 3: Chuyển protein gel lên màng lai
Để các protein có thể phát hiện được kháng thể thì protein phải được chuyển từ gel lên màng lai. Phương pháp chính để chuyển các protein được gọi là phương pháp thẩm tách điện là sử dụng một dòng điện để kéo các protein từ gel lên màng PVDF hoặc màng nitrocellulose. Các protein được chuyển lên màng mà vẫn duy trì sự sắp xếp như trên bản gel. Kết quả là protein sẽ được phơi ra trên lớp mỏng bề mặt để tiến hành xác định
Bước 4: Xử lý màng lai [Blocking]
Do kháng thể và protein đích đều là protein, nên thường thực hiện các bước để ngăn chặn liên kết giữa màng và kháng thể được sử dụng để xác định protein mục tiêu. Việc ngăn chặn các liên kết không đặc hiệu bằng cách đặt màng vào dung dịch protein loãng albumin huyết tương bò 3-5 % [BSA] hoặc sữa bột không béo trong Tris – Buffered saline [TBS]. Protein trong dung dịch loãng sẽ gắn với màng ở tất cả các vị trí mà protein đích chưa gắn vào. Do đó khi kháng thể được bổ sung vào, sẽ không còn chỗ bám trên màng ngoại trừ các vị trí liên kết đặc hiệu với protein đích. Điều này làm giảm nhiễu cơ bản trong sản phẩm cuối cùng của Western Blot, cho kết quả rõ ràng và ngoại trừ hiện tượng dương tính giả.
Bước 5: Quá trình lai và phát hiện vị trí lai
Để phát hiện các protein chuyên biệt, màng được dò protein quan tâm bằng kháng thể đã biến đổi có khả năng liên kết với enzyme thông báo, enzyme này khi kết hợp với một cơ chất tương ứng sẽ thúc đẩy phản ứng hấp thụ quang và tạo màu. Quá trình này diễn ra gồm 2 bước:
- Màng lai đã cố định protein được lai với kháng thể sơ cấp. Kháng thể sơ cấp là một kháng thể đặc hiệu được tao ra khi cho vật chủ hay môi trường nuôi cấy tế bào miễn dịch tiếp xúc với protein quan tâm.
- Sau khi rửa màng để loại bỏ kháng thể sơ cấp chưa liên kết, màng tiếp tục gắn kháng thể thứ hai [kháng thể thứ cấp] có gắn enzyme [thường sử dụng horseradish peroxidase]. Tiếp tục ủ màng lai trong một hỗn hợp phản ứng đặc hiệu với enzyme. Đặt 1 tấm phim ngạy cảm với tia X lên màng lai để phát hiện các điểm sáng phát ra do enzyme.
Có thể sử dụng nhiều phương pháp để phát hiện kháng thể thứ cấp: sử dụng bức xạ hồng ngoại gần liên kết với kháng thể gắn chất huỳnh quang, sử dụng đánh dấu phóng xạ
3. Ứng dụng:
Xác định sự hoạt động của gel thông qua sự có mặt của protein trong môNhận dạng protein mục tiêuĐánh giá tính chuyên biệt của kháng thểPhân tích bệnh do vi khuẩn và virus gây ra: thử nghiệm khẳng định HIV, viêm gan BNăm 2002, đã ứng dụng thành công phương pháp Western Blot trong việc xác định kháng nguyên giun đũa chó [Toxocara canis] trên thỏ [Olga Lucia Morales và ctv, 2002], mở ra một hướng đi mới trong việc xét nghiệm chẩn đoán chính xác các bệnh ký sinh trùng trên người.ThS. Đỗ Thị Phượng Linh
Tài liệu tham khảo
Olga Lucia Morales, 2002. Identification of Toxocara canis antigen by Western Blot in experimentally infected rabbits. Rev. Inst. Med.trop. S. Paulo 44 [4]:213 – 216.