Đề tài nghiên cứu nhiễm Helicobacter pylori

Tên đề tài luận án:  Nghiên cứu tỷ lệ nhiễm Helicobacter pylori ở bệnh nhân mày đay mạn và hiệu quả điều trị bằng phác đồ ba thuốc diệt vi khuẩn

Chuyên ngành: Da liễu

Mã số:    62720152

Họ và tên nghiên cứu sinh: Nguyễn Thị Liên 

Họ và tên Người hướng dẫn: 

PGS.TS Phạm Văn Linh

PGS.TS Nguyễn Tiến Thịnh

Cơ sở đào tạo: Viện Nghiên cứu Khoa học Y Dược lâm sàng 108

Tóm tắt những đóng góp mới của luận án:                     

Mày đay là phản ứng mao mạch của da gây nên phù khu trú ở trung bì cấp hay mạn tính. Mày đay mạn là bệnh phổ biến, có cơ chế sinh bệnh phức tạp. Bệnh gây ra bởi nhiều nguyên nhân khác nhau, dễ nhận biết nhưng rất khó tìm được nguyên  nhân chính xác do vậy điều trị mày đay mạn còn nhiều khó khăn.

Vi khuẩn Helicobacter pylori (H. pylori ) là một vi khuẩn Gram âm có tỷ lệ nhiễm cao ở người. Từ nhiều năm nay, nhiễm H. pylori đã được khẳng định là có liên quan chặt chẽ với bệnh viêm, loét dạ dày tá tràng. Gần đây, trên thế giới có nhiều nghiên cứu nhận thấy vi khuẩn H. pyloricó vai trò trong sinh bệnh học của mày đay mạn; có mối liên quan giữa tình trạng nhiễm H.pylori với lâm sàng của mày đay mạn; đồng thời điều trị diệt vi khuẩn này cũng được báo cáo đi cùng với sự thuyên giảm tình trạng bệnh. Đây là hiểu biết mới, chưa có nhiều nghiên cứu ở Việt Nam, vì thế kết quả của đề tài có ý nghĩa thời sự khoa học và có đóng góp mới cho ngành Da liễu.

Kết quả điều trị mày đay mạn có nhiễm H. pylori bằng kết hợp phác đồ 3 thuốc diệt vi khuẩn với thuốc kháng histamine H1 đơn thuần cho thấy nhóm MĐM/H. pylori+ đáp ứng điều trị diệt vi khuẩn có hiệu quả điều trị mày đay mạn tốt hơn và tỷ lệ kiểm soát tốt bệnh sau 3 tháng cao hơn so với nhóm MĐM/H.pylori+không đáp ứng và nhóm MĐM/H.pylori-. Kết quả này của nghiên cứu có đóng góp mới cho chuyên ngành và cho công tác quản lý, điều trị bệnh mày đay mạn ở Việt Nam hiện nay.

THE NEW MAIN SCIENTIFIC CONTRIBUTION OF THE THESIS

Name of thesis:Research on the prevalence of  Helicobacter pylori infection in patients with chronic urticaria and the effectiveness with bacterialeradication by triple therapy

Speciality: Dermatology

Code: 62720152

PhD Student: Nguyen Thi Lien

Supervisors:

Ass. Prof. Pham Van Linh MD, PhD.

Ass. Prof. Nguyen Tien Thinh MD, PhD.

Educationnal foundation: 108 Institute of Clinical Medical and Pharmaceutical Sciences.

Summary of new main scinetific contribution of the thesis:

Urticaria is a capillary reaction of the skin that causes acute or chronicedema  in the epidermis. Chronic urticaria (CU) is a common disease with complex pathogenesis. The disease has many endogenous and exogenous causes and triggers, is easily identifiable, clinically, but difficult to find the exact cause or to proposean etiologically based treatment.

Helicobacter pylori (H. pylori) is a frequent gastrointestinal infectious agent,  having worldwide distribution.Recent studies suggest a possible association between H. pylori infection and chronic urticaria. In fact, in some investigation CU patients showed regression of cutaneous signs and symptoms after H. pylori eradication treatment. Until now, there have not many studies likeling chronic urticaria with H.pyloriin Vietnam. This is the scientific significance that make the thesis results have a new contribution to the Dermatologycal speciality

Treatment results ofH.pyloriinfectedchronic urticaria by combining three – antimicrobial agent regimen with H1 receptor antagonist showed highereffectivenessin the  CU/H.pylori + eradicated group  with high rate of well-controlled disease after 3 months comparing to thoseof CU/H.pylori+Un-eradicated group and CU/H.pylorinegative group. These findings create paths for futur studies contributing to the more  national management and treatment of chronic urticaria in Vietnam.

Nghiên cứu tình trạng tái phát và tái nhiễm Helicobacter pylori bằng xác định tính đa hình gen UreC ở bệnh nhân loét hành tá tràng.Nhiễm Helicobacter pylori (H. pylori) là một trong những loại nhiễm khuẩn mãn tính hay gặp nhất ở người [1]. Ước tính đến năm 2015 có khoảng 4,4 tỷ người trên toàn thế giới nhiễm vi khuẩn này [2]. Đã có nhiều nghiên cứu khẳng định vai trò của H. pylori trong cơ chế bệnh sinh của bệnh viêm loét dạ dày tá tràng, u MALT cũng như ung thư dạ dày [3]. Đặc biệt, H. pylori được coi là nguyên nhân chính gây loét dạ dày tá tràng là một bệnh phổ biến trên thế giới cũng như ở nước ta với tỷ lệ mắc chiếm tới 5% đến 10% dân số thế giới [4]. Chính vì vậy, việc tiệt trừ H. pylori giúp điều trị hiệu quả bệnh viêm loét dạ dày tá tràng có nhiễm H. pylori và quan trọng hơn là có thể ngăn ngừa được sự phát triển của ung thư dạ dày [5],[6]. Trong nhiều thập kỷ qua, các phác đồ tiệt trừ H. pylori đã được áp dụng điều trị cho bệnh nhân loét dạ dày tá tràng có nhiễm H. pylori. Tuy nhiên, tiệt trừ hoàn toàn H. pylori là một thách thức với giới y học nói chung và chuyên ngành tiêu hóa nói riêng.

Bằng chứng là tình trạng tái xuất hiện (recurrence) H. pylori sau tiệt trừ gặp ở nhiều quốc gia và khu vực kể cả ở các nước phát triển. Nghiên cứu của Gisbert và CS thấy tỷ lệ tái xuất hiện H. pylori sau tiệt trừ trung bình trên toàn thế giới hàng năm là 4,3% đến 4,5% [7],[8]. Nhìn chung, tỷ lệ này ở các nước đang phát triển cao hơn so với ở các nước phát triển (13% so với 2,7%) [9]. Một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến tái xuất hiện H. pylori là hiệu quả của các phác đồ tiệt trừ H. pylori. Vào những năm đầu 1990, tỷ lệ tiệt trừ H. pylori của các phác đồ có thể đạt trên 80% [10]. Tuy nhiên, theo thời gian các phác đồ tiệt trừ H. pylori dần giảm hiệu quả do vi khuẩn kháng kháng sinh ngày càng tăng [11]. Bên cạnh đó, yếu tố phát triển kinh tế xã hội và điều kiện vệ sinh môi trường cũng có mối liên quan mật thiết với tình trạng tái xuất hiện H. pylori sau tiệt trừ [12].2 Có hai hình thức tái xuất hiện H. pylori sau tiệt trừ là tái phát (recrudescence) và tái nhiễm (reinfection). Tái phát là nhiễm lại các chủng H. pylori trước điều trị và tái nhiễm là sau khi tiệt trừ thành công bệnh nhân lại nhiễm lại một chủng H. pylori khác với chủng nhiễm trước điều trị. Phân biệt tái phát và tái nhiễm giúp cho chuyên ngành tiêu hóa có định hướng, có chiến lược điều trị phù hợp. Đối với tái phát, bác sĩ lâm sàng cần thay đổi và lựa chọn phác đồ điều trị thích hợp. Đối với tái nhiễm, giải pháp là tìm nguyên nhân, các biện pháp phòng như tránh lây nhiễm trong gia đình, cải thiện điều kiện vệ sinh và môi trường sống. Để chứng minh tình trạng tái nhiễm hay tái phát H. pylori, chúng ta cần phải phân biệt được kiểu gen giữa các chủng nhiễm trước và sau điều trị tiệt trừ. Có nhiều phương pháp sinh học phân tử xác định kiểu gen của vi khuẩn trong đó PCR- RFLP và PCR giải trình tự gen để xác định kiểu gen các chủng H. pylori là hai phương pháp hiện đang được áp dụng phổ biến trong nghiên cứu và thực tiễn lâm sàng. Do kiểu gen của H. pylori có tính đa hình cao nên việc lựa chọn gen xác định chính xác sự hiện diện của H. pylori là rất quan trọng. Các gen hay được lựa chọn là các gen ổn định ở hầu hết các chủng H. pylori như 16S rRNA, UreC, UreA còn được coi là các gen “giữ nhà” (housekeeping genes). Trong đó, phân tích gen UreC được sử dụng trong nhiều nghiên cứu xác định sự hiện diện của H. pylori do có độ đặc hiệu cao và giúp xác định các chủng H. pylori [13]. Nhiều công trình nghiên cứu đã thực hiện tại nhiều quốc gia phân biệt tình trạng tái phát và tái nhiễm H. pylori sau điều trị tiệt trừ vi khuẩn này ở các bệnh nhân loét dạ dày tá tràng cho kết quả rất khác nhau. Tại các nước đã phát triển, các nghiên cứu cho thấy tỷ lệ tái phát cao hơn tái nhiễm. Trong khi đó ở các nước đang phát triển, tỷ lệ tái nhiễm lại cao hơn [8]. Tại Việt Nam, chưa có nhiều công trình nghiên cứu phân biệt tình trạng tái phát và tái nhiễm

H. pylori bằng phương pháp sinh học phân tử. Xuất phát từ thực tiễn đánh giá3 hiệu quả điều trị tiệt trừ vi khuẩn H. pylori và phân biệt tái nhiễm hay tái phát sau điều trị tiệt trừ H. pylori ở bệnh nhân loét tá tràng – một bệnh phổ biến ở nước ta và có tỷ lệ loét tái phát cao, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tình trạng tái phát và tái nhiễm Helicobacter pylori bằng xác định tính đa hình gen UreC ở bệnh nhân loét hành tá tràng” với hai mục tiêu:

1. Phân tích tỷ lệ kháng Amoxicillin, Clarithromycin và hiệu quả phác đồ Esomeprazole-Amoxicilin-Clarithromycin (EAC) trên bệnh nhân loét tá tràng có Helicobacter pylori dương tính

2. Xác định tình trạng tái phát và tái nhiễm Helicobacter pylori sau điều trị tiệt trừ thành công, bằng kỹ thuật PCR-RFLP và giải trình tự xác định gen Ure

MỤC LỤC Trang Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục Danh mục các chữ, ký hiệu viết tắt Danh mục bảng ĐẶT VẤN ĐỀ……………………………………………………………………………………………………..1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU …………………………………………………………..4 1.1. Helicobacter pylori và bệnh loét tá tràng………………………………………….. 4 1.1.1. Helicobacter pylori ……………………………………………………………….. 4 1.1.2. Bệnh loét tá tràng ………………………………………………………………… 12 1.2. Tái nhiễm và tái phát Helicobacter pylori sau điều trị tiệt trừ ……………. 20 1.2.1. Khái niệm tái nhiễm và tái phát vi khuẩn Helicobacter pylori …… 20 1.2.2. Tình hình tái phát và tái nhiễm của H. pylori sau điều trị tiệt trừ .. 21 1.2.3. Các yếu tố liên quan đến tái phát và tái nhễm H. pylori ……………. 24 1.2.4. Ý nghĩa của phân biệt tái nhiễm và tái phát của Helicobacter pylori .. 29 1.3. Các phương pháp phân biệt bộ gen của Helicobacter pylori và phương pháp PCR –RFLP, giải trình tự gen xác định gen UreC …………………….. 30 1.3.1. Các phương pháp phân tích bộ gen của vi khuẩn H. pylori ……….. 30 1.3.2. Gen UreC …………………………………………………………………………… 30 1.3.3. Phương pháp PCR- RFLP (PCR- Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn)…………………………………………………………………………………………….. 32 1.3.4. Phương pháp giải trình tự gen ……………………………………………….. 33 1.3.5. So sánh hai phương pháp PCR –RFLP và giải trình tự gen trong xác định chủng H. pylori……………………………………………………………………… 36 1.3.6. Các nghiên cứu kiểu gen H. pylori bằng phương pháp PCR-RFLP và giải trình tự gen ……………………………………………………………………….. 37 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…………….40 2.1. Đối tượng nghiên cứu…………………………………………………………………… 402.1.1. Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân nghiên cứu………………………………….. 40 2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ bệnh nhân nghiên cứu ………………………………. 40 2.1.3. Nơi tiến hành nghiên cứu …………………………………………………….. 40 2.2. Phương pháp nghiên cứu ………………………………………………………………. 40 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu……………………………………………………………… 40 2.2.2. Cỡ mẫu nghiên cứu ……………………………………………………………… 41 2.2.3. Các bước tiến hành nghiên cứu ……………………………………………… 43 2.2.4. Các chỉ tiêu nghiên cứu………………………………………………………… 50 2.2.5. Phương tiện nghiên cứu………………………………………………………… 54 2.2.6. Xử lý số liệu ……………………………………………………………………….. 56 2.2.7. Khống chế sai số …………………………………………………………………. 58 2.3. Đạo đức nghiên cứu……………………………………………………………………… 58 2.4. Sơ đồ nghiên cứu …………………………………………………………………………. 59 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU……………………………………………………….60 3.1. Kết quả điều trị loét hành tá tràng có Helicobacter pylori dương tính bằng phác đồ EAC ……………………………………………………………………………….. 60 3.1.1. Đặc điểm chung của mẫu nghiên cứu …………………………………….. 60 3.1.2. Triệu chứng lâm sàng và đặc điểm nội soi trước điều trị………….. 61 3.1.3. Đặc điểm mức độ nhiễm H. pylori trên mô bệnh học ……………….. 62 3.1.4. Tỷ lệ kháng kháng sinh Clarithromycin và Amoxycillin của H. pylori. 62 3.1.5. Kết quả điều trị của phác đồ EAC………………………………………….. 63 3.1.6. Đánh giá tác dụng không mong muốn của phác đồ điều trị……….. 68 3.1.7. Ảnh hưởng của kháng Clarithromycin và Amoxicillin tới hiệu quả điều trị của phác đồ EAC ………………………………………………………………. 68 3.2. Tình trạng tái phát và tái nhiễm H. pylori sau điều trị ………………………. 71 3.2.1. Sơ đồ về tình trạng tái xuất hiện H. pylori và tái phát ổ loét sau điều trị tiệt trừ H. pylori ……………………………………………………………………….. 71 3.2.2. Đặc điểm tái phát và tái nhiễm H. pylori sau điều trị tiệt trừ của nhóm nghiên cứu………………………………………………………………………….. 73 3.2.3. Kết quả sinh PCR-RFLP và giải trình tự gen UreC của các chủng H. pylori nhiễm trước và sau điều trị tiệt trừ…………………………………….. 763.2.4. Minh họa kết quả sinh học phân tử so sánh chủng H. pylori trước và sau điều trị tiệt trừ. ……………………………………………………………………….. 90 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN………………………………………………………………………………..95 4.1. Phân tích tỷ lệ kháng Amoxicillin, Clarithromycin và hiệu quả phác đồ Esomeprazole-Amoxicilin-Clarithromycin (EAC) trên bệnh nhân loét tá tràng có Helicobacter pylori dương tính ………………………………………….. 95 4.1.1. Đặc điểm nhóm nghiên cứu ………………………………………………….. 95 4.1.2. Triệu chứng lâm sàng…………………………………………………………… 96 4.1.3. Kích thước, số lượng và vị trí ổ loét dạ dày, tá tràng………………… 97 4.1.4. Tỷ lệ kháng kháng sinh Clarithromycin và Amoxicillin của H. pylori . 98 4.1.5. Kết quả điều trị của phác đồ EAC trong điều trị loét tá tràng…… 100 4.1.6. Ảnh hưởng của kháng kháng sinh đối với hiệu quả điều trị của phác đồ EAC……………………………………………………………………………………… 108 4.2. Xác định tình trạng tái phát hay tái nhiễm Helicobacter pylori sau điều trị tiệt trừ thành công, bằng kỹ thuật PCR-RFLP và PCR giải trình tự xác định gen UreC ……………………………………………………………………………. 112 4.2.1. Tỷ lệ tái xuất hiện H. pylori sau điều trị tiệt trừ thành công …….. 112 4.2.2. Tỷ lệ tái phát ổ loét tá tràng…………………………………………………. 115 4.2.3. Kết quả phân biệt tái phát và tái nhiễm H. pylori sau điều trị tiệt trừ H. pylori thành công……………………………………………………………………. 116 4.3. Hạn chế của nghiên cứu………………………………………………………………. 126 KẾT LUẬN……………………………………………………………………………………………………..128 KIẾN NGHỊ…………………………………………………………………………………………………….130 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN…………………………………….131 TÀI LIỆU THAM KHẢO ……………………………………………………………………………..133

PHỤ LỤC

DANH MỤC BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ Biểu đồ Tên biểu đồ Trang Biểu đồ 3.1. Phân bố bệnh nhân theo giới……………………………………………… 60 Biểu đồ 3.2. Phân bố bệnh nhân theo nhóm tuổi…………………………………….. 61 Biểu đồ 3.3. Phân tích Kapplan-Meier của tỷ lệ bệnh nhân tái xuất hiện H. pylori sau tiệt trừ thành công………………………………………….. 75 Biểu đồ 3.4. Tỷ lệ tái phát và tái nhiễm H. pylori sau điều trị tiệt trừ …….. 77 Sơ đồ 1.1. Cơ chế gây loét tá tràng của H. pylori …………………………………… 17 Sơ đồ 2.1. Sơ đồ chọn mẫu nghiên cứu …………………………………………………. 43 Sơ đồ 3.1. Tái xuất hiện H. pylori sau điều trị tiệt trừ……………………………… 71

Sơ đồ 3.2. Tái phát ổ loét sau điều trị tiệt trừ …………………………………………. 72

DANH MỤC HÌNH Hình Tên hình Trang Hình1.1. Hình thái của H. pylori………………………………………………………………………..4 Hình 1.2. Tỷ lệ nhiễm H. pylori trong quần thể cư dân trên toàn thế giới ……….6 Hình 1.3. Nội soi dạ dày bằng ánh sáng thường ……………………………………………….9 Hình 1.4. Nội soi dạ dày phóng đại ……………………………………………………………………9 Hình 1.5. Ổ loét hành tá tràng…………………………………………………………………………..15 Hình 1.6. Tỷ lệ tái xuất hiện H. pylori toàn cầu………………………………………………..23 Hình 1.7. Thay đổi hình thái H. pylori từ hình que, hình V, hình U sang hình cầu…………………………………………………………………………………………….26 Hình 1.8. Hình ảnh mô phỏng màng sinh học của H. pylori…………………………..27 Hình 1.9. Kết quả PCR-RFLP của sản phẩm khuếch đại gen UreC từ 12 chủng vi khuẩn H. pylori ………………………………………………………………….33 Hình 1.10 . So sánh thang điện di và các đỉnh sóng huỳnh quang ………………….35 Hình 2.1. Hình ảnh kết quả Urease test ……………………………………………………………45 Hình 2.2. Các vật liệu dùng để nuôi cấy H. pylori…………………………………………….47 Hình 2.3. Hình ảnh khuẩn lạc H. pylori …………………………………………………………..47 Hình 2.4. Đĩa kháng sinh đồ với Amoxicillin và Clarithromycin sử dụng Etest………………………………………………………………………………………………………53 Hình 2.5. Máy PCR……………………………………………………………………………………………55 Hình 2.6. Bộ điện di …………………………………………………………………………………………..55 Hình 2.7. Máy giải trình tự………………………………………………………………………………..56 Hình 2.8. Sơ đồ nghiên cứu ………………………………………………………………………………60 Hình 3.1. Thang DNA chuẩn dùng trong phân tích sản phẩm của PCR từ bệnh phẩm sinh thiết dạ dày……………………………………………………………..79 Hình 3.2. Minh họa hình ảnh PCR gen UreC 820 bp của mã số bệnh phẩm từ 1 đến 7…………………………………………………………………………………80 Hình 3.3. Kết quả sản phẩm PCR sau khi được cắt với enzym cắt giới hạn Hha I (H)…………………………………………………………………………………………..80 Hình 3.4. Sản phẩm PCR-RFLP của mẫu bệnh phẩm từ 1 đến 6…………………..81Hình 3.5. Sản phẩm PCR-RFLP của mẫu bệnh phẩm từ 7 đến 12…………………82 Hình 3.6. Sản phẩm PCR-RFLP của mẫu bệnh phẩm từ 13 đến 18……………….83 Hình 3.7. Hình ảnh PCR gen UreC 820 bp……………………………………………………..90 Hình 3.8. Phân tích PCR khuếch đại đoạn DNA 820cặp bazơ từ mảnh sinh thiết với enzym cắt giới hạn Hha I (H)……………………………………..90 Hình 3.9. Phân tích PCR khuếch đại đoạn DNA 820cặp bazơ từ mảnh sinh thiết với các enzym cắt giới hạn Mbo I (M)………………………………90 Hình 3.10. Phân tích PCR khuếch đại đoạn DNA 820cặp bazơ từ mảnh sinh thiết với các enzym cắt giới hạn Hind III (Hn) ………………………..91 Hình 3.11. Trình tự 712bp gen UreC của chủng H. pylori trước điều trị……….91 Hình 3.12. Sắc phổ một đoạn trình tự gen UreC của chủng H. pylori trước điều trị ……………………………………………………………………………………..91 Hình 3.13. Trình tự 712bp gen UreC của chủng H. pylori sau điều trị…………..92 Hình 3.14. Sắc phổ một đoạn trình tự gen UreC của chủng H. pylori sau điều trị………………………………………………………………………………………………..92

Hình 3.15. So sánh trình tự hai chủng H.pylori trước và sau điều trị……………..9