BioMedia
Điện di polyacrylamide với SDS [viết tắt là SDS - PAGE] là một kỹ thuật được sử dụng thường xuyên trong phòng thí nghiệm nhằm mục đích phân tách các protein dựa trên khối lượng phân tử và tốc độ di chuyển khác nhau của chúng qua gel polyacrylamide, dưới tác dụng của điện trường một chiều. Mặc dù kỹ thuật này được sử dụng rất thường xuyên nhưng nhiều người vẫn chưa hiểu hoàn toàn về nó, do đó bài báo này sẽ cung cấp những thông tin đầy đủ nhất về “quá trình hoạt động của SDS - PAGE”.
Xây dựng mối liên hệ giữa tốc độ điện di và khối lượng phân tử của protein
Theo lý thuyết, tốc độ di chuyển của bất kỳ vật chất nào trong điện trường phụ thuộc vào điện tích, kích thước phân tử của vật đó, và cường độ của điện trường. Nhưng vấn đề ở đây là, điện tích và kích thước phân tử của các protein tự nhiên [tồn tại ở trạng thái gấp khúc] không phụ thuộc vào khối lượng phân tử của protein đó. Điện tích của một protein phụ thuộc vào thành phần amino acid của nó, còn kích cỡ phân tử lại phụ thuộc vào cấu trúc không gian bậc 3 của protein. Do đó, các phân tử protein tự nhiên khác nhau có cùng khối lượng phân tử có thể di chuyển với tốc độ khác nhau trong cùng một điện trường, tùy theo điện tích và cấu trúc 3D của các protein đó.
Như vậy, để có thể phân tách được các protein trong điện trường bằng khối lượng phân tử của chúng, ta cần phá vỡ cấu trúc không gian của protein, đưa protein về dạng cấu trúc bậc 1, và cân bằng điện tích của các protein khác nhau. Đây chính là công việc của SDS - sodium dodecyl sulphate.
Chức năng của SDS
SDS được dùng để phá vỡ cấu trúc bậc 3 của protein. SDS được thêm vào đệm điện di cùng với những chất khử như DDT [dithiotheitol] hoặc B-ME [beta-mercaptoethanol] để phá vỡ liên kết disulfide trong protein, biến protein từ dạng không gian [cấu trúc bậc 3] về dạng thẳng [cấu trúc bậc 1]. Đồng thời SDS tích điện âm cho protein, làm cho điện tích của phân tử protein lớn hơn hẳn điện tích có sẵn của nó [tồn tại ở gốc R trong amino acid]. SDS bám lên protein theo một tỷ lệ ổn định [xấp xỉ 1.4g SDS/ 1g protein], và điều này làm cho điện tích mới của phân tử protein tỷ lệ với khối lượng phân tử của nó.
SDS được thêm vào trong thành phần gel để duy trì trạng thái biến tính của protein [duỗi thẳng, tích điện âm] trong suốt quá trình điện di.
Hình 1: Quá trình biến tính protein của SDS
Như vậy, yếu tố duy nhất ảnh hưởng tới sự di chuyển của các phân tử protein được biến tính bởi SDS chính là kích thước phân tử của chúng. Phân tử protein được biến tính và tích điện âm bởi SDS sẽ tồn tại ở dạng thẳng, có chiều rộng khoảng 18 Å, chiều dài tỷ lệ với khối lượng phân tử [do tồn tại ở dạng thẳng]. Kích thước phân tử protein [cùng với đó là tốc độ di chuyển trong gel] được quyết định bởi khối lượng phân tử của protein. Điện tích của protein không ảnh hưởng tới quá trình điện di, do các phân tử protein đã được tích điện âm bởi SDS, và điện tích của mỗi protein lại tỷ lệ với khối lượng phân tử của chính nó.
Do đó, dưới tác dụng của điện trường, các phân tử protein đã được biến tính sẽ di chuyển về phía cực dương với tốc độ khác nhau, tùy theo kích thước phân tử của chúng. Sự khác nhau này sẽ được thể hiện một cách rõ ràng khi phân tử protein chạy qua gel. Gel polyacrylamide không bị ảnh hưởng bởi các hóa chất biến tính protein như SDS, B-TM,… và có thể được pha với nhiều nồng độ khác nhau, tạo ra các loại gel có kích thước lỗ gel khác nhau, phù hợp với các quá trình phân tách khác nhau, do đó được sử dụng một cách rộng rãi.
Hệ đệm điện di không liên tục và lớp gel cô
Trong quá trình điện di, đệm điện di có vai trò là môi trường để duy trì dòng điện ổn định chạy trong gel. Loại đệm điện di được sử dụng phổ biến nhất trong SDS – PAGE là hệ đệm không liên tục Laemmli. “Không liên tục” nghĩa là loại đệm được sử dụng trong gel và trong bể điện di khác nhau. Hệ đệm không liên tục Laemmli gồm lớp gel cô có pH = 6.8, lớp gel tách có pH = 8.8 và đệm điện di ở pH = 8.3, trong đó lớp gel cô có nồng độ acrylamide thấp hơn so với lớp gel tách.
Hình 2: Hệ đệm không liên tục Laemmli
Vậy thì sự khác biệt về pH có vai trò gì trong quá trình điện di? Glycine trong đệm điện di có thể tồn tại ở 3 trạng thái khác nhau là trạng thái trung hòa về điện, tích điện âm và tích điện dương, tùy vào pH của môi trường. Điều khiển trạng thái tích điện của glycine bởi các hệ đệm khác nhau là chức năng chính của hệ đệm không liên tục, và thông qua lớp gel cô để cố định lại protein trước khi phân tách.
Hình 3: Ba trạng thái tích điện khác nhau của phân tử glycine.
Khi quá trình điện di bắt đầu, các ion glycine tích điện âm trong đệm [có pH = 8.3] được đẩy vào trong lớp gel cô. Dưới pH = 6.8 ở đây, các phân tử glycine bị chuyển thành dạng trung hòa về điện tích, làm cho tốc độ di chuyển của chúng bị giảm đi đáng kể trong điện trường. Trái ngược với glycine, các ion Cl‑ di chuyển nhanh hơn trong điện trường, và chúng hình thành nên một lớp ion ở phía trước các phân tử glycine. Sự di chuyển của ion Cl‑ về phía cực dương của bể điện di tạo nên một vùng hẹp có gradient điện áp chênh nhau rất lớn ở 2 đầu, phía trước là ion Cl‑ có khả năng di chuyển nhanh, phía sau là ion glycine trung tính. Toàn bộ các phân tử protein được tra vào giếng được cô lại giữa 2 lớp ion Cl‑ và glycine.
Khi phân tử chạy tới lớp gel tách có pH = 8.8, các phân tử glycine chuyển sang trạng thái tích điện âm, di chuyển nhanh hơn các ion phân tử Cl‑; chúng vượt qua các phân tử Cl‑ ở phía trước để di chuyển về cực dương. Điều này làm cho các phân tử protein bị cố định dưới hình dạng các băng ở vùng tiếp giáp giữa 2 lớp gel cô và gel tách. Cùng với đó, do nồng độ acrylamide trong lớp gel tách lớn hơn lớp gel cô, các phân tử protein sẽ di chuyển chậm đi, và quá trình phân tách bắt đầu diễn ra.
Nếu như bạn không sử dụng lớp gel cô, điều gì sẽ xảy ra? Các giếng trên gel acrylamide có độ sâu khoảng 1cm, và thường phải được tra đầy để có đủ protein cho quá trình điện di. Nếu như không có lớp gel cô, phía trên lớp gel tách sẽ là lớp mẫu có độ dày tới 1cm. Khi đó, protein trong mẫu sẽ di chuyển hết vào trong lớp gel tách vào các thời điểm khác nhau, dẫn tới các băng điện di sẽ bị smear. Chức năng chính của lớp gel cô là làm cho protein bị nén lại dưới dạng các băng, đồng thời chắc chắn rằng các băng protein sẽ di chuyển vào trong lớp gel tách trong cùng 1 thời điểm.
Khi protein di chuyển vào lớp gel tách, chúng sẽ được phân tách dựa trên khối lượng phân tử. Protein có khối lượng phân tử lớn sẽ di chuyển chậm hơn protein có khối lượng phân tử nhỏ hơn. Tùy vào loại protein cần phân tách mà nồng độ polyacrylamide có thể được điều chỉnh cho phù hợp. Đối với các trường hợp cần phổ phân tách lớn, hoặc đối với các protein khó phân tách, có thể sử dụng gel gradient gồm nhiều lớp acrylamide có nồng độ khác nhau.
Tác giả: TS. Nick Oswald
Nguồn bitesizebio.com
Link bài gốc: //bitesizebio.com/580/how-sds-page-works/
Dịch giả Nguyễn Khánh Toàn
Biên soạn BioMedia VN
Gel nói chung và gel thực phẩm nói riêng là một hình thức trung gian giữa rắn và lỏng. Đây là liên kết ngang trong các phân tử polymer và tạo một mạng lưới giữa các phân tử trong một môi trường lỏng.
Gel thực phẩm
Trong thực phẩm, chất lỏng này là nước, một dung môi có ảnh hưởng đến đặc thù và khả năng hút lẫn nhau giữa những phân tử giữ sự toàn vẹn của mạng lưới polyme. Mạng lưới này giữ được nước. Thực phẩm chế biến và tăng trưởng loại sản phẩm mới yên cầu những thành phần như những chất tạo gel để thiết kế xây dựng một mạng lưới hệ thống cấu trúc mong ước trong thực phẩm. Gel hoàn toàn có thể được diễn đạt bởi khả năng của nó để cố định và thắt chặt những chất lỏng, bởi cấu trúc phân tử của gel, cấu trúc của gel và tính chất lưu biến .
Gel thực phẩm là chất viscoelastic và gel hóa một số sản phẩm được sản xuất trên toàn thế giới. Gel hình thành trong thực phẩm thường là polysaccharides và protein.
- Trong gel thực phẩm, các phân tử polymer được giữ bởi các liên kết cộng hóa trị với trừ liên kết disulfua trong một số gel protein. Thay vào đó, các phân tử được tồn tại bởi sự kết hợp của các lực liên phân tử yếu như liên kết hydro, lực tĩnh điện, lực Van der Waals và tương tác kỵ nước.
- Polysaccharides bao gồm hydrocolloids mạnh mẽ ngậm nước trong môi trường nước nhưng nó có xu hướng có cấu trúc khó xác định.
Cơ chế của gel phụ thuộc vào bản chất của các gel và các điều kiện hình thành gel như nhiệt độ, sự hiện diện của các ion, pH, và nồng độ của các chất tạo gel,…
Bạn đang đọc: Gel thực phẩm và các yếu tố ảnh hưởng đến hệ Gel – Foodnk
Có 2 quy trình tạo gel hầu hết diễn ra trong quy trình sản xuất bánh là sự tạo gel protein và sự tạo gel polysaccharide. Cơ chế tạo gel của 2 quy trình này gần giống nhau và gel polysaccharide tạo ra có cấu trúc chắc và bền hơn gel protein .
Các yếu tố ảnh hưởng
Bản chất và tính chất của gel bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như nồng độ protein, pH, tính chất, và nồng độ của chất điện phân. Gel có thể xảy ra trong quá trình gia nhiệt, làm lạnh và phụ thuộc vào tính chất của protein và quá trình tự nó. Sự hình thành do nhiệt gây ra của mạng gel liên quan đến các hệ thống kết hợp của chuỗi gấp polypeptide thông qua các không kết cộng hóa trị [ví dụ như liên kết hydro, tương tác ion và kỵ nước] và trong một số trường hợp, thông qua liên kết hóa trị [liên kết disulfua].
Xem thêm: Đồng hồ Eco-Drive là gì? Ưu điểm nổi bật và cách nhận biết
Protein-protein. Các mối liên kết giữa các phân tử chéo giữa các chuỗi hình thành của các polypeptide khác nhau và rất cần thiết để hình thành gel. Các loại liên kết cộng hóa trị không tương tác, chẳng hạn như kỵ nước và tương tác Van der Waals, hydro và các tương tác ion có liên quan đến bản chất của protein, nồng độ của nó, độ pH, với cường độ biến tính gây ra bằng cách nung nóng và can thiệp vào những lực hút cơ bản của mạng lưới ba chiều. Vì vậy, làm phân tán mạng lưới này bằng tạo ra một lực hút lớn hơn.
Xem thêm: TỔNG QUAN NGÀNH HÀNG TIÊU DÙNG – CONSUMER GOODS
Nói về chất của gel nhờ vào vào sự cân đối giữa sức mạnh hút và đẩy của những phân tử protein tham gia vào mạng lưới hệ thống. Nếu lực mê hoặc chiếm lợi thế, coagulum một được hình thành và nước được giữ bởi mạng lưới hệ thống mạng. Nếu tăng nhanh, mạng lưới ba chiều không hề được hình thành . Một hệ gel là trạng thái mà chất lỏng và rắn phân tán vào nhau, trong đó mạng lưới chất rắn chứa những thành phần chất lỏng kết dính lại tạo thành gel. Sự ngưng tụ của những hạt sẽ tạo thành mạng lưới. Tăng nồng độ dung dịch, đổi khác pH hoặc tăng nhiệt độ nhằm mục đích giảm rào cản tĩnh điện cho những hạt tương tác để những hạt kết tụ với nhau tạo thành gel. Nếu nung ở nhiệt độ thông thường thì mẫu sản phẩm là gel khô, nếu nung ở điều kiện kèm theo siêu tới hạn mẫu sản phẩm là gel khí .
FOODNK