Phương pháp sắc ký trao đổi ion
|
Academia.edu no longer supports Internet Explorer. To browse Academia.edu and the wider internet faster and more securely, please take a few seconds to upgrade your browser.
Sắc ký trao đổi ion (Ion – exchange chromatography)BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC QUỐC TẾ HỒNG BÀNGKHOA DƯỢC – BỘ MÔN HÓA PHÂN TÍCHSẮC KÝ TRAO ĐỔI ION(Ion – exchange chromatography)Lớp14ĐH-DS1LỜI NÓI ĐẦU1Sắc ký trao đổi ion (Ion – exchange chromatography)Sắc ký là một phương pháp tách quan trọng dựa trên các quá trình hấp thụ trongđiều kiện động học. Trong phương pháp sắc ký, quá trình tách được thực hiện liêntục bằng cách cho các pha tiếp xúc với nhau nhiều lần ở trên cột, trên giấy haytrên bản mỏng.Pha được giữ nguyên gọi là pha tĩnh. Pha di động, tiếp xúc với pha tĩnh gọi làpha động. Trong quá trình tiếp xúc giữa pha tĩnh và pha động, các cấu tử cầnphân tích sẽ phân bố khác nhau giữa các pha ấy phụ thuộc vào bản chất của chấtphân tích, bản chất của pha tĩnh và pha động, nhờ đó mà ta có thể tách đượctừng cấu tử riêng biệt.Ngày nay, sắc ký ion là kỹ thuật sắc ký chung nhất được áp dụng khi muốn táchhỗn hợp thành các dạng ion riêng rẽ.Có rất nhiều kỹ thuật sắc ký ion khác nhau; tuy nhiên sắc ký ion được phân loạitheo cơ chế phân cách điện tử như sau: Ion - exchange chromatography Ion - exclusion chromatography Ion - pair chromatography Ion - suppression chromatographyPhương pháp sắc ký ion quan trọng nhất là sắc ký trao đổi ion (ion - exchangechromotography – IEC) vì là cơ chế chung, bao hàm cho tất cả các kỹ thuật sắc kýion khác, được ứng dụng rất nhiều trong cách lĩnh vực Hóa Sinh, Công Nghệ SinhHọc, và kiểm nghiệm trong Dược học.1. NGUYÊN TẮCSắc ký trao đổi ion dựa trên sự ái lực khác nhau của các ion và đầu charge trái dấuionic (nhựa trao đổi ion) trong pha tĩnh. Các ion và ionic sẽ hút vào nhau nhờlực hút tĩnh điện giữa các phân tử mang điện tích trái dấu.Dựa theo điện tích trao đổi trên bề mặt, nhựa trao đổi ion phân loại như sau: Nhựa trao đổi cation:2Sắc ký trao đổi ion (Ion – exchange chromatography) Phân tử ion âm gắn kết trên bề mặt ionit Cationit acid mạnh có nhóm acid sulfonic –SO3-H+ Cantionit acid yếu có nhóm acid carboxylic –COO-H+ Nhựa trao đổi anion: Phân tử ion dương gắn kết trên bề mặt ionit Anionit base mạnh có nhóm amin bậc 4 –N(CH3)3+OH Anionit base yếu có nhóm amin bậc 1 –NH3+OHHình 1: Nhựa trao đổi cation và anion2. CƠ CHẾ2.1 Cân bằng trao đổi ionQuá trình trao đổi ion dựa trên cân bằng trao đổi giữa các ion trong dung dịch vàcác ion trên bề mặt pha tĩnh. Trao đổi ion A+ và B+ giữa một dung dịch và cột Rnhư sau:Hằng số cân bằng trao đổi ion:A.R + B+ B.R + A+3Sắc ký trao đổi ion (Ion – exchange chromatography)Nếu nồng độ A+ trong dung dịch lớn thì cân bằng chuyển sang trái, tức là B+ bịphản hấp phụ. Vì vậy, chất nào có Kex càng lớn sẽ bị lưu giữ mạnh trên ionit (B.Rtăng cao) và ngược lại.Hằng số phân bố:Ví dụ:Hình 2: Cationit axit mạnh –SO3-H+ gắn kết với cation K+Cationit axit mạnh có nhóm –SO3-H+ phản ứng với cation K+ theo phương trìnhphản ứng sau:Resin –SO3-H+ + K+ Resin –SO3-K+ + H+Tương tự, khi trao đổi ion C- và D- và cột sắc ký E+C.E + D- D.E + CKex chính là ái lực hấp thu của ionit với chất phân tích phụ thuộc vào điện tích4Sắc ký trao đổi ion (Ion – exchange chromatography)của ion, kích thước hydrat hóa của nó và các tính chất khác. Mặt khác KD cònphụ thuộc nồng độ H+ theo tỷ lệ ngược.2.2 Pha động trong sắc ký trao đổi ionTrong phản ứng trên E là chất rửa giải hay pha động, X là nhóm trao đổi ion trênpha tĩnh. Quá trình rửa giải - hoàn nguyên tái sinh ionit theo cơ chế cạnh tranh vịtrí hấp thu vào pha tĩnh, vai trò phóng thích những ion đang gắn trong cột. Khităng nồng độ ion của pha động, các ion này sẽ thay thế ion chất ban đầu, gắn vàopha tĩnh, ion ban đầu sẽ ra ngoài cột theo trình tự độ lớn về điện tích.Hình 3: Ion Cl- gắn kết trên pha tĩnh của anionit – NH3+ và cạnh tranh liên kết với RCO2-Có 4 căn cứ để lựa chọn pha động như sau: Kiểu phát hiện chất phân tích; Độphức tạp của mẫu phân tích; Loại chất phân tích và Loại cột được sử dụng.Thông thường, pha động là các dung dịch đệm có pH xác định, để tách các ionkim loại người ta còn thêm các chất tạo phức, mục đích cuối cùng là để cạnhtranh liên kết của ion với cột R, tách ion ra khỏi cột và thu được ion cần thiết.Với hỗn hợp chất ban đầu có nhiều hợp chất khác nhau, có nhiều hợp chất mangđiện tích.2.3 Trình tự giai đoạn sắc ký trao đổi ionHình 4: Giai đoạn trong quá trình trao đổi ion5Sắc ký trao đổi ion (Ion – exchange chromatography)-Giai đoạn 1: Nhựa trao đổi ion cân bằng với các đối ion của nó. Các hợp chất-cần phân tích sẳn sàng đi ngang qua nhựa.Giai đoạn 2: Nhựa trao đổi ion đang bị cạnh tranh gắn kết với các ion cầnphân tích, các đối ion của nhựa sẽ bị loại ra khỏi nhựa, sau giai đoạn cân bằng-này, việc giải ly sẽ được thực hiện.Giai đoạn 3: Ion của dung dịch rửa giải đang cạnh tranh trao đổi với nhựa để-đẩy tách hợp chất ra khỏi nhựaGiai đoạn 4: Gia tăng nồng độ dung dịch rửa giải, để ion dung dịch rửa giải đủmạnh để cạnh tranh đẩy các ion ra khỏi nhựa- Giai đoạn 5: Tái tạo nhựa, trở lại tình trạng như ban đầu3. CÁCH TIẾN HÀNH- Cần xem thông tin về nhựa do nhà sản xuất cấp để tính toán lượng nhựa sửdụng, số lượng nhựa quy ra thể tích sau khi trương nở trong dung dịch cho-phù hợp.Sử dụng cột sắc ký ngắn, đường kính lớn vì nếu quá dài thì các hợp chất saukhi ly giải sẽ bám vào gần hay xa đầu cột. ngoài ra các áp suất của cột bị sụt-giảm thất thường, làm cho ảnh hưởng đến quá trình tách các hợp chất.Nhồi nhựa vào trong cột:6Sắc ký trao đổi ion (Ion – exchange chromatography)o Giữ cột thẳng đứng trên giá, khóa vòi bên dưới cột.o Nhựa trao đổi được cân bằng trong dung dịch đệm sao cho có thể rótdễ dàng vào cột mà không xuất hiện bọt khí.o Để yên 5-10 phút cho nhựa lắng xuống, rót đầy cột bằng dung dịchđệm, mở khóa cho nhựa lắng xuống.o Khi nhồi cột hoàn tất, cân bằng bằng cách cho dung dịch đệm chảy qua-cột, kiểm tra pH của dung dịch chảy ra khỏi cột.Nạp mẫu chất lên đầu cột:o Dung dịch mẫu phải được lọc trong suốt trước khi nạp vào cộto Mở khóa để hạ mức dung dịch đệm xuống vừa sát mức nhựa trên đầucột, khóa lại.o Dùng pipet hút và đặt dung dịch mẫu trên đầu cột, mở khóa cho dungdịch mẫu hút vào lớp nhựa trên đầu cột. Để yên 10-20 phút cho mẫuchất tiếp xúc cân bằng với nhựao Khi tất cả lượng mẫu đã được gắn lên đầu cột nhựa, cho vài ml dungdịch đệm ban đầu chảy qua cột, nối cột với bình cung cấp dung dịchđiện ly.7Sắc ký trao đổi ion (Ion – exchange chromatography)-Hình 5: Các bước tiến hành của sắc ký trao đổi ionTái sinh ionit: Loại bỏ những tạp chất và hoạt chất còn dính trong nhựa bằngcách rửa nhiều lần bằng nước muối đậm đặc và tăng dần nồng độ cho đến2M/lít. Các hoạt chất tạp bẩn khác có thể rửa với NaOH 0,1M và sau đó rửanhựa với nước cất và dung dịch nước muối cho đến khi dung dịch qua lọc hếttính base.4. ỨNG DỤNG TRONG NGÀNH DƯỢC8Sắc ký trao đổi ion (Ion – exchange chromatography)Hình 6: Sơ đồ chung của một hệ thống sắc ký ionỨng dụngPhương pháp trao đổi ion được dùng nhiều trong khử độ cứng của nước do cácmuối hòa tan dưới dạng ion Ca2+ và Mg2+, tinh chế các chất thử hóa học, tinh chếcác chất không điện ly ra khỏi hỗn hợp điện ly, tách chiết protein, tách hợp chất rakhỏi hỗn hợp…Biphosphonate DrugThuốc điều trị về các bệnh về xương như: hypercalceamia, osteoporosis(loãngxương), Paget’s disease.Ứng dụng phương pháp sắc ký trao đổi ion kết hợp UV để định tính các hợp chấtcủa Biphosphonate.9Sắc ký trao đổi ion (Ion – exchange chromatography)Hình 7: Cấu trúc tổng quát của--BiphosphonateCột nhựa trao đổi anion: IC – Pak HR, PAX 100…Điều kiện tiến hành:o Dung môi ở pH = 2-3: HNO3 (2-10mM) + 0-20% acetonitrite, acidsuccinic, acid citrico Dung dịch tái sinh ionit: NaOH pH = 9.5Kết quả :Hình 8: Dẫn xuất khác nhau của Biphosphonate cho kết quả SIM khác nhau.10Sắc ký trao đổi ion (Ion – exchange chromatography)Hình 9: Đồ thị biểu diễn của Etidronate sau khi đã được tách bởi sắc kýMỗi dẫn xuất của Biphosphonate khi ra khỏi cột cho một thông số thời gian khácnhau, dễ dàng định tính các hợp chất riêng rẽ để đạt hiệu quả mong muốn.-Tách chiết proteinProtein với điện tích trái dấu sẽ gắn vào giá thể trong khi các protein khác bịrửa trôi khỏi cột. Sau khi rửa trôi các hợp chất, protein gắn với giá thể sẽ được-chiết xuất bằng lực ion cao (muối nồng độ cao) hoặc thay đổi pH.Protein tích điện dương nếu pH < pI khi đó nó sẽ gắn với cột cationit (tích điện-âm)Protein tích điện âm nếu pH > pI khi đó nó sẽ gắn với cột anionit (tích điện-dương)Trên cùng 1 protein, có những vùng tích điện khác nhau so với điện tích tổngthể.11Sắc ký trao đổi ion (Ion – exchange chromatography)Hình 10: Tách chiết protein bằng sắc ký trao đổi ionTÀI LIỆU THAM KHẢO1.Lokesh Bhattacharyya, Ion Chromatography in Pharmaceutical Drug Characterization,Dionex IC Users Meeting Providence, October 16, 20112.www.chromacademy.com/lms/sco111/theory_of_hplc_ion-chromatography.pdf3.Leo Jinyuan Wang, Marcus Miller, and William Schnute, Quantitative Determinationof Bisphosphonate Pharmaceuticals and Excipients by Capillary Ion ChromatographyMass Spectrometry, Thermo Fisher Scientiic, Sunnyvale, CA, USA12Sắc ký trao đổi ion (Ion – exchange chromatography)13
các sắc ký trao đổi ion là một kỹ thuật phân tích dựa trên các nguyên tắc sắc ký để tạo ra sự phân tách các loài ion và phân tử thể hiện tính phân cực. Điều này dựa trên tiền đề về việc các chất này tương tự như thế nào trong mối quan hệ với một chất trao đổi ion khác. Theo nghĩa này, các chất có điện tích được tách riêng nhờ sự dịch chuyển ion, trong đó một hoặc nhiều loài ion được chuyển từ chất lỏng sang chất rắn bằng cách trao đổi, do có điện tích bằng nhau. Những loài ion này được liên kết với các nhóm chức nằm trên bề mặt bằng các tương tác kiểu tĩnh điện tạo điều kiện trao đổi ion. Ngoài ra, hiệu quả của việc tách các ion phụ thuộc vào tốc độ trao đổi vật chất và sự cân bằng giữa cả hai giai đoạn; đó là, dựa trên sự chuyển giao này. Chỉ số
Thủ tụcTrước khi bắt đầu quá trình sắc ký trao đổi ion nên tính đến các yếu tố nhất định có liên quan lớn, cho phép tối ưu hóa quá trình tách và thu được kết quả tốt hơn. Trong số các yếu tố này là lượng chất phân tích, khối lượng mol hoặc khối lượng phân tử của mẫu và tải trọng của loài tạo nên chất phân tích. Các yếu tố này là không thể thiếu để xác định các tham số của sắc ký, chẳng hạn như pha tĩnh, kích thước của cột và kích thước lỗ rỗng của ma trận, trong số các yếu tố khác. Cân nhắc trướcCó hai loại sắc ký trao đổi ion: loại liên quan đến chuyển vị cation và loại liên quan đến dịch chuyển anion.. Trong lần đầu tiên, pha động (tạo thành mẫu cần tách) có các ion mang điện tích dương, còn pha tĩnh có các ion mang điện tích âm. Trong trường hợp này, các loài có điện tích dương bị thu hút bởi pha tĩnh tùy thuộc vào cường độ ion của chúng và điều này được phản ánh trong thời gian lưu được thể hiện trong sắc ký đồ. Tương tự, trong sắc ký liên quan đến sự dịch chuyển anion, pha động có các ion tích điện âm, trong khi pha tĩnh có các ion tích điện dương.. Nói cách khác, khi pha tĩnh có điện tích dương, nó được sử dụng để phân tách các loài anion và khi pha này có bản chất anion, nó được sử dụng để phân tách các loài cation có trong mẫu.. Trong trường hợp các hợp chất có điện tích và thể hiện khả năng hòa tan trong nước (như axit amin, nucleotide nhỏ, peptide và protein lớn), chúng kết hợp với các mảnh có điện tích trái dấu, tạo ra liên kết có tính chất ion với pha văn phòng phẩm không hòa tan. Thủ tụcKhi pha tĩnh ở trạng thái cân bằng, có một nhóm chức dễ bị ion hóa, trong đó các chất quan tâm của mẫu được tách riêng và định lượng, và có thể được kết hợp trong khi di chuyển dọc theo cột sắc ký. Sau đó, các loài đã được kết hợp có thể được rửa giải và sau đó được thu thập bằng cách sử dụng dung môi. Chất này được cấu thành bởi các yếu tố cation và anion, tạo ra nồng độ ion lớn hơn dọc theo cột hoặc điều chỉnh các đặc tính pH của cùng một. Tóm lại, đầu tiên một loài có khả năng trao đổi các ion được tích điện dương với các phản ứng, và sau đó sự kết hợp của các ion sẽ được tiết ra được tạo ra. Khi quá trình rửa giải bắt đầu, các loài ion bị ràng buộc yếu bị giải hấp. Sau này, các loài ion có liên kết mạnh hơn cũng bị khử. Cuối cùng quá trình tái sinh xảy ra, trong đó có thể trạng thái ban đầu được phục hồi bằng phương pháp rửa cột với các loài được đệm xen kẽ ban đầu. Nguyên tắcSắc ký trao đổi ion dựa trên thực tế là các loài biểu hiện điện tích có trong chất phân tích, được phân tách nhờ các lực hấp dẫn của loại tĩnh điện, khi chúng di chuyển qua một chất dẻo thuộc loại ion trong Điều kiện cụ thể của nhiệt độ và pH. Sự phân tách này được gây ra bởi sự trao đổi thuận nghịch của các loại ion giữa các ion được tìm thấy trong dung dịch và những chất được tìm thấy trong chất chuyển vị nhựa có bản chất ion.. Theo cách này, quy trình được sử dụng để phân tách các hợp chất trong mẫu phải tuân theo loại nhựa được sử dụng, theo nguyên tắc của các bộ trao đổi anion và cation được mô tả ở trên.. Khi các ion quan tâm bị giam cầm trong chất nhựa, có thể cột sắc ký sẽ chảy cho đến khi phần còn lại của các loại ion được rửa giải. Sau đó, các loại ion bị giam cầm trong nhựa được phép chảy, trong khi di chuyển qua pha động có độ phản ứng lớn hơn dọc theo cột. Ứng dụngNhư trong loại sắc ký này, việc tách các chất được thực hiện do trao đổi ion, nó có một số lượng lớn các ứng dụng và ứng dụng, trong số đó là: - Tách và tinh chế các mẫu chứa sự kết hợp các hợp chất có tính chất hữu cơ, bao gồm các chất như nucleotide, carbohydrate và protein. - Kiểm soát chất lượng trong xử lý nước và trong các quá trình khử ion và làm mềm dung dịch (được sử dụng trong ngành dệt may), cũng như phân tách magiê và canxi. - Tách và tinh chế thuốc, enzyme, chất chuyển hóa có trong máu và nước tiểu và các chất khác có hành vi kiềm hoặc axit, trong ngành dược phẩm. - Khử khoáng các dung dịch và các chất, nơi mong muốn thu được các hợp chất có độ tinh khiết cao. - Cách ly một hợp chất cụ thể trong một mẫu mà bạn muốn tách, để có được sự phân tách chuẩn bị giống nhau để sau đó phải phân tích thêm. Tương tự, phương pháp phân tích này được sử dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp hóa dầu, thủy luyện, dược phẩm, dệt may, thực phẩm và đồ uống và bán dẫn, trong số các lĩnh vực khác. Tài liệu tham khảo
|
