Giải thích công thức tính kết quả định lượng vitamin B12 bằng phương pháp đo quang

--- Bài mới hơn ---

                                                                               ThS. Lương Công Quang

                                                                  Khoa Công nghệ Hóa-Tài nguyên và Môi trường

Đồng (Cu) là khoáng chất được cơ thể hấp thụ ở dạ dày và phần trên của ruột non, sau đó đi vào máu. Đồng có tác dụngchống oxy hóa, ngừa ung thư, tốt cho tim mạch và rất cần thiết cho sự hoạt động của hệ thần kinh. Chất này có nhiều trong rau có màu xanh đậm, khoai tây, nấm, tôm, cua hay lúa mạch,…Đồng ảnh hưởng đến nhiều quá trình sinh hóa của cây như quá trình cố định N, sự khử nitrat, sự khử CO2, sự tổng hợp chloroplyll, tổng hợp các chất điều hòa sinh trưởng, sự thoát hơi nước, sự chuyển hóa gluxit, tạo các mô mới thân lá rễ, và ảnh hưởng đến tính chịu hạn, chịu lạnh, chịu nóng của cây.

Đồng là nguyên tố vi lượng giúp cây trồng sinh trưởng và phát triển, ảnh hưởng đến sự tổng hợp nhiều loại chất đường, bột, hợp chất có đạm, chất béo, chloroplyll và các sắc tố khác, vitamin C và các enzim.

Đồng tồn tại trong nước dưới dạng ion Cu2+, hoặc dưới dạng phức xianua, tactrat…với hàm lượng không lớn dao động trong khoảng từ 0.001 đến 1mg/l. Để xác định hàm lượng đồng, người ta thường sử dụng phương pháp AAS, tuy nhiên ở một số phòng thí nghiệp chưa có máy AAS có thể dùng phương pháp trắc quang với thuốc thử dietyldithiocarbamate (DDC).

1. Nguyên lý của phương pháp

Phản ứng giữa Cu2+ với Pb-DDC xảy ra tại giá trị pH = 1.0 đến 1.5, trong trường hợp này ngoài đồng còn có Bi, Hg, Ag cùng tham gia phản ứng, các nguyên tố còn lại không tham gia phản ứng nên phương pháp này có độ chọn lọc cao vì Ag và Hg không gây cản trở do phức của chúng không màu.

Loại bỏ các ảnh hưởng:

– Bi: Nếu hàm lượng này vượt quá 30 µg/l thì cần phải lắc phức DDC kim loại với 25ml HCl 5M trong 5 phút, do đó phức Bi-DDC bị phân hủy còn phức Cu-DDC không bị phân hủy.

– Phức Cu-xianua: thêm 0,5ml H2­SO4(1:1), 5ml HNO3 đặc vào 200 – 250ml mẫu chứa trong cốc chịu nhiệt, làm bay hơi dung dịch đến gần cạn khô (quá trình phân hủy nên đặt trong tủ hút). Để nguội, thêm vào 1ml HCl đặc và làm bay hơi đến khô, để nguội, thêm nước cất hai lần, đun nóng dung dịch đến sôi để hòa tan hết lượng muối rắn, lọc và chuyển toàn bộ dung dịch vào bình  mức thích hợp.

1. Thiết bị và dụng cụ và hóa chất

– Phểu chiết thể tích 250 ml hoặc 500ml; máy UV-VIS; các dụng cụ thông thường ở phòng hóa nghiệm;

– H2SO4 1:1, HNO3 đậm đặc, HCl đậm đặc, dung môi hữu cơ toluene hoặc tương đương, Na-DDC, Pb-DDC trong toluene;

Chuẩn bị một phểu chiết sạch thể tích 1000ml, thêm vào 50-100ml nước cất hai lần, 0.1 g Pb(NO3)2 loại tinh khiết phân tích, lắc kĩ để muối tan hết. Hòa tan 0.1 g Na-DDC trong lượng nước tối thiểu rồi thêm vào phểu chiết để kết tủa hết Pb-DDC, thêm vào phểu chiết 250ml toluene, đậy nút phểu chiết và lắc mạnh, toàn bộ kết tủa Pb-DDC sẽ tan hết vào trong toluene, tách bỏ tướng nước, phần tướng hữu cơ được lọc qua giấy lọc cho vào bình màu nâu, dung dịch bền trong ba tháng.

– Dung dịch Cu2+ chuẩn nồng độ 1µg/ml.

– Lấy một thể tích nước cần phân tích sao cho chứa khoảng 0,2 – 0,6 µgCu/l, cho vào phễu chiết có thể tích 200-500ml, pha loãng mẫu nước nếu cần đến thể tích 100ml rồi thêm vào 5 giọt HCl(1:1), từ buret thêm vào một cách chính xác 10ml Pb-DDC trong toluene hoặc dung môi hữu cơ (có thể dùng petroleum thay thế). Cẩn thận đậy nút phểu chiết lại và lắc trong hai phút, giữ yên phễu chiết để cho hai tướng phân lớp, tách bỏ phần tướng nước phía dưới, phần tướng hữu cơ có chứa Cu-DDC có màu vàng được chuyển vào cuvet và tiến hành so màu tại bước sóng 430nm.

– Lấy vào các phễu chiết: 0.2ml; 0.5ml; 1.0ml; 2.0ml; 3.0ml; 4.0ml; 5.0ml; 6.0ml dung dịch chuẩn Cu2+ có nồng độ 1µg Cu/ml, pha loãng bằng nước cất đến 100ml và tiến hành chiết tách như mẫu thử. Tiến hành với mẫu trắng song song.

Dùng phần mềm để xây dựng đường chuẩn. Nếu R2 <0,99 thì phải tiến hành lại thí nghiệm. Ngược lại tìm phương trình đường chuẩn y = a.x +b

Từ phương trình đường chuẩn tính kết quả phân tích theo công thức sau:

Trong đó: y là mật độ quang của mẫu phân tích

a và b là các hằng số

V1 là thể tích bình định mức (mL);

V2 là thể tích mẫu (mL).

TÀI LIỆU THAM KHẢO:

. TCVN 6193:1996 –ISO 8288: 1986(E). . Lê Đức, Giáo trình Một số phương pháp phân tích môi trường, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội, 2022. . Võ Anh Khuê, Giáo trình các phương pháp phân tích hóa lý, trường Cao đẳng Công thương miền Trung, 2022.

--- Bài cũ hơn ---

--- Bài mới hơn ---

Mẫu chuẩn C: cân chính xác 37,5 mg paracetamol chuẩn vào bình định mức

100 mL, thêm 25 mL dung dịch natri hydroxyd 0,1 N và 50 mL nước, lắc 15 phút, bổ

sung nước cất đến vạch. Lấy chính xác 10 mL dịch lọc cho vào bình định mức 50 mL.

Thêm nước vừa đủ đến vạch, lắc đều. Sau đó, hút chính xác 10 mL dung dịch trên cho

vào bình định mức 100 mL, thêm 10 mL dung dịch natri hydroxyd 0,1 N, thêm nước

đến vạch định mức, lắc đều thu được dung dịch chuẩn có nồng độ 7,5 µg/mL.

Mẫu thử T: cân chính xác một lượng bột thuốc khoảng 75 mg paracetamol vào

bình định mức 100 mL, thêm 25 mL dung dịch natri hydroxyd 0,1 N (TT) và 50 mL

nước, lắc 15 phút, thêm nước đến định mức. Lắc đều, lọc qua giấy lọc khô, bỏ 10 mL

dịch lọc đầu. Lấy chính xác 10 mL dịch lọc cho vào bình định mức 100 mL. Thêm

nước vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lấy chính xác 10 mL dung dịch trên cho vào bình định

mức 100 mL, thêm 10 mL dung dịch natri hydroxyd 0,1 N (TT), thêm nước đến định

mức, lắc đều.

Mẫu giả lập GL: tiến hành tạo mẫu giả định bằng cách cân tất cả các thành

phần trong công thức một viên ứng với 75 mg paracetamol. Mẫu giả định được xử lý

tương tự như mẫu thử T trước khi đo quang.

Mẫu giả dược GD: mẫu giả dược được tạo ra và xử lý tương tự mẫu giả lập GL

(ngoại trừ thành phần không có chứa paracetamol).

Mẫu trắng: dung dịch NaOH 0,01 N.

hợp với các tá dược tan được để tạo được lỗ xốp như lactose (Hoàng Ngọc Hùng,

2012).

Các tá dược tạo khung thân nước: với cơ chế dùng các polyme không tan

nhưng trương nở tạo một lớp gel thân nước bao quanh viên giúp kiểm soát sự phóng

thích hoạt chất. Các polyme thân nước hay sử dụng là hydroxypropyl methylcellulose

(HPMC), gôm xanthan, acid polyacrylic (cacbopol) (Hoàng Ngọc Hùng, 2012).

2.4.THỬ NGHIỆM ĐỘ HÒA TAN TRONG NGHIÊN CỨU VÀ ĐÁNH GIÁ

CHẤT LƯỢNG THUỐC

Thử nghiệm độ hòa tan là phép thử nhằm đánh giá tốc độ, mức độ giải phóng và

hòa tan dược chất ngoài cơ thể. Độ hòa tan phản ánh động học phóng thích hoạt chất

của viên và khả năng thuốc sẵn sàng hấp thu khi sử dụng (Mohhamad Hosain và

JamesWW. Ayres, 1996).

Điều kiện trong phép đo độ hòa tan

Thiết bị đo hòa tan: hiện nay có 7 loại thiết bị đo hòa tan được giới thiệu trong

Dược Điển các nước (The United States Pharmacopeial Convention, 2013). Trong đó,

kiểu giỏ quay và kiểu cánh khuấy là hai kiểu thiết bị đo hòa tan thông dụng nhất.

15

Cácthiết bị này phải đảm bảo các thông số kỹ thuật trong USP 36 và phải được chuẩn

hóa (The United States Pharmacopeial Convention, 2013).

Tốc độ quay: 50, 75 hay 100 vòng/phút là tùy vào chuyên luận quy định trong

các Dược Điển hoặc dạng bào chế và tính chất lý hóa của hoạt chất (The United States

Pharmacopeial Convention, 2013).

Môi trường: được chỉ dẫn trong từng chuyên luận riêng hay các dung môi hòa

tan hoạt chất, tùy thuộc tính của dạng thuốc nghiên cứu (The United States

Pharmacopeial Convention, 2013).

Thể tích môi trường: thông thường là 500, 750, 900, 1000 mL, phụ thuộc vào

tính chất lý hóa và dạng bào chế của hoạt chất (The United States Pharmacopeial

Convention, 2013).

Thời gian thử nghiệm: tùy theo yêu cầu của từng dạng thuốc (The United

States Pharmacopeial Convention, 2013).

Vị trí lấy mẫu:ở khoảng giữa bề mặt dung môi và mặt trên cách khuấy, cách

thành cốc 1 cm (Robert B. Raffa, 2005).

Thời điểm lấy mẫu: đối với thuốc phóng thích kéo dài, mẫu thường được lấy ở

ít nhất ba thời điểm để đánh giá độ phóng thích hoạt chất in vitro. Lấy mẫu lần thứ

nhất ở thời điểm 1 hay 2 giờ để khẳng định không có sự phóng thích ồ ạt. Mẫu thứ hai

thường được lấy ở thời điểm giữa của quá trình để xây dựng đồ thị phóng thích in

vitro. Mẫu cuối cùng được chọn lấy vào thời điểm cuối của quá trình để biết phần trăm

hoạt chất được phóng thích tối đa. Thời điểm và số lần lấy mẫu được xây dựng dựa

trên hồ sơ giải phóng hoạt chất của thuốc (The United States Pharmacopeial

Convention, 2013).

2.5.TỒNG QUAN VỀ QUANG PHỔ UV – VIS

Phương pháp phân tích quang phổ là phương pháp phân tích quang học dựa trên

việc nghiên cứu sự tương tác của bức xạ ánh sáng trên chất khảo sát hoặc sự hấp thụ

các bức xạ dưới một tác động hóa lý nào đó(Trần Tứ Hiếu, 2008).

 Phổ UV – Vis và nguồn gốc của sự hấp thụ(Lê Nhất Tâm, 2014)

– Vùng phổ này thường được chia làm 3 vùng chủ yếu: cận UV (185 – 400 nm), khả

kiến (400 – 700 nm) và cận hồng ngoại (700 – 1100 nm).

– Nguồn gốc của sự hấp thụ trong vùng này chủ yếu là sự tương tác của các photon

của bức xạ với các ion hay phân tử của mẫu.

– Sự hấp thụ chỉ xảy ra khi có sự tương ứng giữa năng lượng photon và năng lượng

các điện tử ngoài cùng (của ion hay phân tử) hấp thụ.

– Kết quả của sự hấp thụ là có sự biến đổi năng lượng điện tử của phân tử. Chính vì

vậy phổ UV – Vis được gọi là phổ điện tử.

16

– Sự hấp thụ năng lượng điện tử trong vùng sóng ánh sáng tử ngoại gần (190 – 400

nm) và khả kiến (400 – 780 nm) của các chất gây ra sự chuyển dịch của các điện tử từ

trạng thái cơ bản sang trạng thái kích thích.

– Biểu đồ biểu diễn sự tương quan giữa cường độ hấp thu theo bước sóng của một

chất được gọi là phổ UV- Vis của chất ấy trong điều kiện xác định.

– Các quang phổ kế UV – Vis đo độ truyền quang T hay độ hấp thu A của bức xạ khi

truyền qua mẫu lỏng.

– Độ truyền quang T được tính:

T=

I

I0

Hay: %T =

I

I0

x 100

– Độ hấp thụ A được xác định: A = -logT

– Tùy vào trạng thái của mẫu đo mà phổ thu được có những đường nét khác nhau:

Hình 2.12.Đồ thị về đường phổ của hai mẫu khác nhau

Chú thích: a: Benzen in solution

b: Benzen vapour

 Sự chuyển dịch điện tử của các hợp chất hữu cơ

– Phần lớn các hợp chất hữu cơ được nghiên cứu trong vùng phổ UV – Vis.

– Quá trình chuyển tiếp bao gồm các điện tử π, σ hay điện tử n nằm trên các orbital

của các nguyên tử nhẹ như H, C, N, O.

 Những yếu tố ảnh hưởng tới sự chuyển mức:

Ảnh hưởng của dung môi:

– Bước sóng hấp thu và cường độ hấp thu của các hợp chất chịu ảnh hưởng của

dung môi.

– Sự tác động của những dung môi khác nhau lên các phân tử làm thay đổi mức

năng lượng giữa các trạng thái kích thích và cơ bản.

17

– Sự tác động của dung môi lên phân tử làm sinh ra chuyển dịch xanh và chuyển

dịch đỏ.

Chuyển dịch xanh:

+ Là hiện tượng hấp thu bức xạ của các hợp chất hữu cơ có bước sóng ngắn hơn

trong những dung môi có tính phân cực cao.

+ Hiện tượng tìm thấy ở quá trình chuyển dịch n π* của nhóm carbonyl.

+ Nguyên nhân là do sự làm bền trạng thái n của dung môi.

Chuyển dịch đỏ

+ Là hiện tượng các hợp chất hữu cơ có xu hướng hấp thu những bức xạ có bước

sóng dài hơn trong những dung môi có độ phân cực cao hơn.

+ Hiện tượng được tìm thấy ở các phân tử hữu cơ mà trong cấu trúc phân tử của nó

có sự liên hợp.

+ Nguyên nhân do khi mạch C càng dài thì hiệu ứng liên hợp càng tăng, dẫn tới độ

lệch năng lượng giữa hai trạng thái giảm và do trong phân tử hữu cơ có hiệu ứng liên

hợp càng dài thì bước sóng hấp thu càng lớn.

Ảnh hưởng của pH

– Ảnh hưởng độ bền của phức.

– Ảnh hưởng đến sự tạo phức.

– Ảnh hưởng dạng tồn tại.

Ảnh hưởng của sự liên hợp

Sự liên hợp p-π hay π-π đều làm cho trạng thái kích thích của điện tử π* bền hơn

có năng lượng thấp hơn đều này dẫn tới bước sóng hấp thu dài hơn.

 Định luật Lambert – Beer:

Chiếu một chùm tia đơn sắc song song có cường độ I0 rọi thẳng góc lên bề dày L

của một môi trường hấp thụ thì sau khi qua lớp hấp thụ này cường độ của ánh sáng

nhỏ đi còn là I (I < I0).

Gọi T là độ truyền qua của ánh sáng thì T =

I

I0

Định luật Lambert – Beer: độ hấp thụ ánh sáng của vật chất tỷ lệ thuận với hai

thành phần là nồng độ chất hấp thụ và khoảng đường của ánh sáng truyền qua vật chất.

A = -lgT = ε.C.l

A: độ hấp thụ

l: chiều dày của lớp hấp thụ (cm)

C: nồng độ của chất hấp thụ (mol/l)

ε: hệ số hấp thụ mol

2.5.1. Cấu tạo máy quang phổ UV-Vis

Cấu tạo của máy quang phổ UV – Vis được trình bày ở hình 2.13.

18

Hình 2.13. Cấu tạo máy quang phổ UV-Vis 6800

2.5.1.1.Nguồn sáng

Nguồn sáng cho máy quang phổ là chùm bức xạ phát ra từ đèn. Máy quang phổ

dùng đèn Hydro hay đèn Deuterium cho phổ phát xạ liên tục trong vùng UV 200-

380nm (nhưng thường sử dụng 200-340nm) và đèn Tungsten Halogen đo vùng 380-

1000nm. Để làm việc cho cả hai vùng thì phải có đủ 2 loại đèn trên. Một yêu cầu đối

với nguồn sáng là phải ổn định, tuổi thọ cao và phát bức xạ liên tục trong vùng phổ

cần đo.

2.5.1.2.Bộ tạo ánh sáng đơn sắc (monochromator)

Bộ đơn sắc có chức năng tách bức xạ đa sắc thành bức xạ đơn sắc, bao gồm

kính lọc, lăng kính hay cách tử. Cách tử là một bảng nhôm hay các kim loại Cu, Ag,

Au, được vạch thành những rãnh hình tam giác song song. Khi chiếu ánh sáng qua

cách tử, phần còn lại có tác dụng tạo nên vân nhiễu xạ có bước sóng khác nhau, khi

quay cách tử sẽ tạo ra phổ nhiễu xạ giống như trường hợp ánh sáng qua lăng kính. Ưu

điểm là cho độ phân giải tốt, tán sắc tuyến tính, độ rộng của dải ổn định, chọn

bướcsóng đơn giản, gọn nhẹ, dễ chế tạo; nên hiện nay sử dụng cách tử tạo ánh sáng

đơn sắc được ưa chuộng. Cách tử dùng cho UV-Vis có 1200 vạch/mm (thường dao

động từ 300-3600 vạch/mm), số vạch càng nhiều thì năng suất phân giải càng cao.

Lăng kính của máy quang phổ dùng lăng kính littrow (lăng kính 30o) bằng thạch

anh, có đặc điểm ánh sáng đi qua lăng kính hai lần do phản xạ ở mặt sau.

2.5.1.3.Detector

Detector là bộ phận đo tín hiệu ánh sáng trước và sau khi đi qua dung dịch

(đựng trong cuvet). Các tín hiệu sau khi đi ra detector sẽ được khuếch đại, lưu giữ và

xử lý trên máy tính.

2.5.1.4.Cuvet đựng mẫu

Cuvet phải làm bằng chất liệu cho bức xạ ở vùng cần đo đi qua. Cuvet thủy tinh

không thích hợp cho vùng UV. Cuvet thạch anh cho bức xạ đi qua từ 190 – 1000 nm.

Cuvet nhựa chỉ dùng trong Vis và chỉ sử dụng được 1 vài lần.

Quang phổ phát xạ

Nguồn sáng + Mẫu Máy đơn sắc Đầu thu

Xử lý

tín hiệu

Huỳnh quang, hấp thu,

Raman

Nguồn sáng Mẫu 

19

2.5.1.5.Bộ khuếch đại tín hiệu (amplificator)

2.5.1.6.Bộ phận ghi

Bộ phận ghi hay đồng hồ đo có 2 thang đo bao gồm:

 Thang đo độ hấp thụ A hay mật độ quang D (Absorbance, Optical Density).

 Thang đo độ thấu quang, độ truyền quang T (Transmittance).

2.5.2. Ưu điểm

– Phương pháp có độ nhạy cao, cho phép xác định nồng độ trong khoảng 10-2 đến

10-6 mol/L (1-10%).

– Phân tích thuận tiện: không đòi hỏi thiết bị, hóa chất quá đắt tiền, có thể phân

tích nhiều đối tượng mẫu khác nhau.

– Dễ tự động hóa: các thao tác từ đưa mẫu phân tích vào, đưa các hóa chất cần

thiết, vẽ phổ, xử lý phổ, xử lý kết quả, xử lý thống kê đều được thực hiện một cách tự

động hóa trên các máy móc, thiết bị hiện đại.

– Phương pháp này rất thuận lợi cho việc nghiên cứu các cơ chế tạo phức, xác

định các dạng tồn tại của ion trung tâm, các ligand nằm trong phức đơn và đa ligand

trong pha nước cũng như pha hữu cơ.

2.5.3. Các sai số trong phép đo

Phương pháp phân tích quang phổ cũng như các phương pháp phân tích khác,

sai số được chia làm hai loại: sai số do tiến hành phản ứng hóa học (hóa chất, thao tác,

dụng cụ), sai số của tín hiệu đo độ hấp thụ của dung dịch (sai số hệ thống). Trong

phương pháp quang phổ thì sai số quan trọng nhất là sai số của tín hiệu trong quá trình

đo độ hấp thu.

2.5.4. Yêu cầu của chất phân tích

Các hợp chất cần xác định phải bền và ít phân ly, ổn định, không thay đổi thành

phần trong khoảng thời gian nhất định để thực hiện phép đo (10 – 20 phút). Hệ số

ɛcàng lớn càng tốt, nồng độ các chất xác định phải tuân theo định luật Lambert – Beer.

Các hợp chất là phức cần đo phải có bước sóng cực đại khác xa bước sóng cực

đại của thuốc thử trong cùng điều kiện, tức là khoảng 80 – 100 nm.

2.5.5. Một số ứng dụng

Phương pháp phổ UV – Vis có ý nghĩa quan trọng trong lĩnh vực phân tích định

tính, phân tích cấu trúc phân tử và phân tích định lượng. Nguyên tắc của phương pháp

phân tích định lượng là dựa vào mối quan hệ giữa mật độ quang và nồng độ dung dịch

của định luật Lambert – Beer, phương pháp định tính là dựa vào hình dáng của phổ và

bước sóng cực đại.

2.5.5.1. Xác định mức độ tinh khiết của hợp chất

Nếu hợp chất trong suốt, các vết của tạp chất dễ phát hiện khi chúng có cường

độ hấp thu đủ mạnh.

20

Nếu hợp chất có vạch hấp thu ở vùng UV – Vis thì cần tinh chế cho đến khi hệ

số phân tử của sự hấp thu đạt giá trị không đổi.

2.5.5.2. Nhận biết và xác định cấu trúc của hợp chất

– Nhận biết sản phẩm của sự tổng hợp bằng cách so sánh đường cong hấp thu của

sản phẩm tổng hợp với đường cong hấp thu của sản phẩm thiên nhiên hay mẫu chuẩn.

– Nhận biết nhóm chức của hợp chất dựa vào quang phổ, các thông tin về các

nguyên tố và phản ứng định tính các nhóm chức. Có thể sử dụng cường độ vạch hấp

thu với mục đích nhận dạng trong trường hợp chất tinh khiết.

– Nhận biết cấu tạo của hợp chất ban đầu dựa vào số liệu hấp thu của các dẫn

xuất hay sản phẩm phân hủy của nó.

– Xác định đồng phân hình học, dạng trans có λmax, 𝜀max lớn hơn dạng cis.

– Xác định sự đồng phân do sự hỗ biến enol – keton, thiol – thion.

2.5.5.3. Phân tích hỗn hợp

– Định tính và định lượng hỗn hợp.

– Điều kiện để có kết quả xác đáng: chất phân tích tuân theo định luật Lambert-

Beer, đã biết hệ số hấp thu của mỗi hợp chất tinh khiết.

2.5.5.4. Xác định trong lượng phân tử

Khi hợp chất ban đầu không hấp thu trong vùng sóng này, nếu nó phản ứng với

tác nhân có vạch hấp thu đặc trưng, cường độ mạnh và độ dài sóng thì hệ số hấp thu

của chất dẫn xuất thu được không khác hệ số của tác nhân.

Nếu hệ số hấp thu này là không đổi trong bất cứ dẫn xuất nào thì mật độ quang

học D sẽ phụ thuộc vào M của chất ban đầu.

𝑀 =

𝜀.𝜔.𝑙

𝐷

Trong đó 𝜔 nồng độ chất

L chiều dày cuvet

2.5.5.5. Xác định hằng số phân ly của acid, base

Ví dụ:HB + H2O ↔ H3O+ +B-

𝑝𝐾𝑎 = 𝑝𝐻 + 𝑙𝑔

CHB

CB−

Quang phổ được sử dụng để xác định lg

CHB

CB−

, đo pH của dung dịch sẽ suy ra p𝐾𝑎.

2.5.5.6. Nghiên cứu phản ứng hóa học

– Theo dõi biến đổi nồng độ các chất trong phản ứng.

– Xác định vận tốc phản ứng.

– Xác định nhiệt sinh của các phân tử không bền.

– Thiết lập công thức thực nghiệm và hằng số tạo phức trong dung dịch.

2.6.THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG

Thẩm định phương pháp là sự khẳng định bằng việc kiểm tra, cung cấp bằng

21

chứngkhách quan để chứng minh rằng phương pháp đó đáp ứng được các yêu cầu đặt

ra (fitness for the urpose). Kết quả của thẩm định phương pháp có thể được sử dụng để

đánh giá chất lượng, độ tin cậy của kết quả phân tích. Thẩm định phương pháp phân

tích là một phần không thể thiếu nếu muốn có một kết quả phân tích đáng tin cậy (Trần

Cao Sơn ctv, 2010).

2.6.1.Khi nào cần thẩm định(Hoàng Ngọc Hùng, 2012)

– Sử dụng một phương pháp mới vào công việc phân tích hằng ngày.

– Thay đổi mục đích sử dụng của phương pháp.

– Giới hạn thu được sau khi phân tích nằm ngoài giới hạn quy định.

– Thay đổi quy trình: thành phần tá dược trong thuốc, trang thiết bị, thông số kỹ

thuật, thay đổi nhà cung cấp hóa chất.

2.6.2.Tầm quan trọng của việc thẩm định(Bộ Y tế, 2011;Nguyễn Lầu Hai,

2014;Nguyễn Thị Diệp Chi, 2008).

Thẩm điṇh quy trình phân tích là môṭ quá trình tiến hành thiết lâp̣ bảng thưc̣

nghiêṃ của các thông số đăc̣ trưng của phương pháp để chứng minh phương pháp đáp

ứng yêu cầu phân tích dư ̣kiến. Nói cách khác, việc thẩm điṇh môṭ quy trình phân tích

yêu cầu chúng ta chứng minh môṭ cách khoa hoc̣ rằng khi tiến hành thí nghiêṃ sai số

mắc phải là rất nhỏ và chấp nhâṇ đươc̣.

Trong các tiêu chuẩn chúng ta phải xây dưṇg phương pháp phân tích hay cũng

goị là quy trình thử nghiêṃ để giúp cho viêc̣ kiểm tra chất lươṇg cũng như các tiêu chí

đề ra cho các tiêu chuẩn đó.

Muc̣ tiêu của viêc̣ thẩm điṇh các phương pháp phân tích là để chứng tỏ rằng quy

trình đáp ứng với nhu cầu dư ̣kiến.

Phương pháp phân tích sau khi thẩm điṇh có thể đưa vào Dươc̣ điển hoăc̣ đưa

vào các tiêu chuẩn cơ sở để xin đăng ký lưu hành.

2.6.3.Nội dung thẩm định(Bộ Y tế, 2013; Đặng Văn Giáp, 2012; Trần Tử An, 2005)

Cơ sở cần thiết cho viêc̣ thẩm điṇh phương pháp phân tích để điṇh lươṇg những

thành phần chủ yếu trong nguyên liêụ thuốc, hoaṭ chất trong các chế phẩm cần dưạ vào

các tiêu chuẩn sau:

– Độ đặc hiệu

– Tính tuyến tính

– Đô ̣lăp̣ laị

– Đô ̣đúng

2.6.3.1. Độ đặc hiệu

Độ đặc hiệu: là khả năng cho phép xác định chính xác và đặc hiệu chất cần

phân tích mà không bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của các chất khác (tạp chất, sản phẩm

phân hủy,) có trong mẫu thử. Tùy đối tượng trong quy trình phân tích mà thực hiện

22

thử nghiệm. Trong quy trình định lượng tính đặc hiệu biểu thị bằng độ chênh lệch hay

là hiệu giữa các kết quả thu được từ một mẫu giả định với các kết quả thu được từ mẫu

thử. Tính đặc hiệu cũng là độ nhiễu của phương pháp. Độ nhiễu càng thấp, tính đặc

hiệu càng cao.

Cách thực hiện:chuẩn bị một mẫu giả định có công thức và thành phần các chất

hoàn toàn giống như mẫu thử và mẫu trắng tức là mẫu bao gồm các thành phần giống

hệt như mẫu thử nhưng không chứa hoạt chất cần định lượng.

Yêu cầu: Sự sai khác giữa hai hệ số góc không quá 2%, chứng tỏ quy trình có

tính chọn lọc với chất phân tích.

2.6.3.2. Tính tuyến tính

Tính tuyến tính của môṭ phương pháp phân tích là khả năng luâṇ ra các kết quả

thử của phương pháp hoăc̣ bằng phép biến đổi toán hoc̣ hay trưc̣ tiếp dưạ vào tương

quan tỷ lê ̣giữa đaị lươṇg đo và nồng đô.̣ Tính tuyến tính trong một miền giá trị được

xác định bằng hệ số tương quan R.

Cách thưc̣ hiêṇ: tiến hành thưc̣ nghiêṃ để xác điṇh ứng với các nồng đô ̣x biết

trước, các giá tri ̣ điṇh lươṇg đươc̣ y. Như ta đa ̃biết nếu y phu ̣thuôc̣ tuyến tính vào x

có nghiã là trong khoảng nồng đô ̣cần khảo sát đường biểu diêñ của y theo x là môṭ

đường thẳng theo phương trình sau: y=ax+b.

Dưạ vào kết quả thu đươc̣ từ thưc̣ nghiêṃ của x và y tương ứng ta tính hê ̣số

tương quan R:

𝑅 =

∑(𝑥 − �̅� ) × (𝑦 − �̅�)

√∑(𝑥 − �̅�)2 × ∑(𝑦 − �̅�)2

Nếu: R=1: có tính tương quan tuyêṭ đối.

R<0: có tương quan nghic̣h biến.

R=0: hoàn toàn không có tương quan tuyến tính.

Sau khi xác nhâṇ đươc̣ khoảng tuyến tính của phương pháp, ta có thể xây dưṇg

phương pháp hồi quy của khoảng này tức là xác điṇh hê ̣số a và b của phương trình

trên:

𝑎 =

∑ 𝑥𝑦 −

∑ 𝑥 ∑ 𝑦

𝑛⁄

∑ 𝑥2 −

(∑ 𝑥)

2

𝑛⁄

; 𝑏 = 𝑦 − 𝑎𝑥

y: giá tri ̣ điṇh lươṇg đươc̣.

x: nồng đô ̣điṇh lươṇg.

Phương trình hồi quy: 𝑦 = 𝑎𝑥 + 𝑏

Yêu cầu: tùy theo hoac̣h điṇh mà choṇ giá tri ̣ R.

23

2.6.3.3. Đô ̣lăp̣ laị

Đô ̣lăp̣ laị (hay đô ̣chính xác) là mức đô ̣sát gần giữa các kết quả thử riêng lẻ với

giá tri ̣ trung bình �̅�thu đươc̣ khi áp duṇg phương pháp đề xuất cho cùng môṭ mâũ thử

đồng nhất trong cùng điều kiêṇ xác điṇh.

Đô ̣lăp̣ laị bi ̣ ảnh hưởng bởi sai số ngâũ nhiên.

Đô ̣lăp̣ laị thường đươc̣ biểu hiêṇ bằng đô ̣lêc̣h chuẩn (SD) hay đô ̣ lêc̣h chuẩn

tương đối (RSD) của môṭ loaṭ các lần thử nghiêṃ.

Cách thưc̣ hiêṇ: độ lặp lại được thực hiện bằng cách tiến hành định lượng tối

thiểu 9 lần mẫu thử ở tối thiểu 3 nồng độ hoặc thực hiện định lượng tối thiểu 6 lần ở

nồng độ 100%. Sau đó áp duṇg công thức tính SD và RSD của phương pháp.

Yêu cầu:RSD càng nhỏ, phương pháp phân tích càng chính xác, RSD do mỗi

phòng thí nghiêṃ đưa ra, thông thường ta choṇ RSD ≤ 2%.

SD = √

∑(𝑥𝑖 −𝑋)

2

𝑛−1

𝑅𝑆𝐷 =

𝑆𝐷

𝑋

× 100%

𝑋 =

∑ 𝑥𝑖

𝑛

X: giá tri ̣ trung bình

2.6.3.4. Đô ̣đúng

Đô ̣đúng của môṭ phương pháp phân tích là mức đô ̣sát gần của giá tri ̣ tìm thấy

với giá tri ̣ thưc̣, khi áp duṇg quy trình đề xuất trên cùng môṭ mẫu thử đa ̃ đươc̣ làm

đồng nhất trong điều kiêṇ xác điṇh. Đô ̣đúng bi ̣ ảnh hưởng bởi sai số hê ̣ thống. Độ

đúng sẽ được tính bằng tỷ lệ phần trăm giữa lượng chất chuẩn tìm thấy so với lượng

chất chuẩn thêm vào.

Cách thưc̣ hiêṇ: tiến hành định lượng tối thiểu 9 lần mẫu thử ở tối thiểu 3 nồng

độ. Từ kết quả thu được xác định tỷ lệ % tìm lại của chất đem thử:

Đ =

𝜇

𝑥

× 100%

Đ: tỉ lê ̣phuc̣ hồi.

μ : hàm lươṇg tìm laị.

x : hàm lươṇg chất chuẩn thêm vào.

Yêu cầu:

Tỉ lê ̣phuc̣ hồi trung bình phải đaṭ: 97% ≤ ĐTB ≤ 103%.

2.7. CÁC NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN

Andrew D. Trafford, Roger D. Jee và các cộng sự (1999) đã sử dụng phương

pháp quang phổ để xác định hàm lượng paracetamol trong nhiều chế phẩm. Kết quả

phương pháp cho thấy khả năng lặp lại tốt, độ lệch chuẩn và hệ số biến thể cho 6 lần

so sánh trong cùng một lô cùng một ngày là 0,14 và 0,16%, sai lệch trung bình -0,22%

và độ chính xác trung bình là 0,45% (Andrew D. Trafford et al., 1999).

24

Ramesh Sawant, Lokesh Bhangale và các cộng sự (2010) đã định lượng

paracetamol bằng phương pháp quang phổ. Phương pháp sử dụng NaOH 0,1M làm

dung môi, đo độ hấp thu tại bước sóng 256 nm. Phương pháp nghiên cứu có ý nghĩa

thống kê vì tất cả các thông số đều nằm trong khoảng chấp nhận được. Ưu điểm

phương pháp đơn giản, nhanh chóng và chính xác (Ramesh Sawant et al., 2010).

25

CHƯƠNG 3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. NGUYÊN LIỆU VÀ TRANG THIẾT BỊ

3.1.1. Nguyên liệu

Các nguyên liệu, chất chuẩn, tá dược và hóa chất được sử dụng trong nghiên

cứu được trình bày trong các bảng 3.1; 3.2 và 3.3.

Bảng 3.1. Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu

Tên nguyên liệu Tiêu chuẩn Nguồn gốc Ứng dụng

Paracetamol USP Malinkrodt (Mỹ) Hoạt chất

Paracetamol chuẩn

(Hàm lượng 99,72%)

Chất chuẩn Viện KN TPHCM Chất chuẩn

Bảng 3.2. Các tá dược dùng trong nghiên cứu

Tên tá dược Tiêu chuẩn Nguồn gốc Ứng dụng

PVP K30 USP Mỹ Tá dược dính

Avicel 101 BP Đài Loan Tá dược độn

DST BP Đài Loan Tá dược rã

HPMC K15M USP Nhật Tạo khung matrix

Magnesi stearat BP Malaysia Tá dược trơn bóng

Bảng 3.3. Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

Tên hóa chất Tiêu chuẩn Nguồn gốc Ứng dụng

Nước cất Nhà sản xuất Việt Nam Pha dung dịch đệm

Acid phosphoric Nhà sản xuất Trung Quốc Pha dung dịch đệm

Dinatri hydrophosphat Nhà sản xuất Trung Quốc Pha dung dịch đệm

Kali dihydrophosphat Nhà sản xuất Trung Quốc Pha dung dịch đệm

Natri hydroxyd Nhà sản xuất Trung Quốc Dung môi pha mẫu

3.1.2.Trang thiết bị

trong bảng 3.4.

STT Tên thiết bị Mã hiệu Nguồn gốc

1 Cân phân tích AND HR200 Nhật

2 Máy UV-Vis Shimazdu 1800 Nhật

3

4

Máy thử độ hòa tan

Máy siêu âm

Pharma Test PTW3C

Elma T840DH

Đức

Đức

5 Máy đo pH Hanna Hi 2210 Mỹ

3.1.3.Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Phòng thí nghiệm bộ môn Bào chế, Kiểm Nghiệm – Khoa Dược, Trường Đại

Học Tây Đô.

Thời gian nghiên cứu từ tháng 01/2017 đến 06/2017.

26

3.2.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Trước khi thẩm định, tiến hành định tính nguyên liệu paracetamol bằng cách đo

bước sóng cực đại hấp thu của mẫu nguyên liệu với mẫu chuẩn bằng phương pháp đo

quang UV – Vis.

3.2.1.Quytrình định lượng paracetamol trong chế phẩm

Khảo sát quy trình định lượng paracetamol thông qua tham khảo chuyên luận

“viên nén paracetamol” trong Dược điển Việt Nam IV, điều chỉnh các bước tiến hành

cho phù hợp với điều kiện thực nghiệm hiện có. Sau đó, tiến hành thẩm định quy trình

định lượng theo Sổ tay đăng ký thuốc – Cục Quản lý Dược Việt Nam (Bộ Y tế, 2013).

Phương pháp xử lý mẫu:

Mẫu chuẩn C: cân chính xác 37,5 mg paracetamol chuẩn vào bình định mức

100 mL, thêm 25 mL dung dịch natri hydroxyd 0,1 N và 50 mL nước, lắc 15 phút, bổ

sung nước cất đến vạch. Lấy chính xác 10 mL dịch lọc cho vào bình định mức 50 mL.

Thêm nước vừa đủ đến vạch, lắc đều. Sau đó, hút chính xác 10 mL dung dịch trên cho

vào bình định mức 100 mL, thêm 10 mL dung dịch natri hydroxyd 0,1 N, thêm nước

đến vạch định mức, lắc đều thu được dung dịch chuẩn có nồng độ 7,5 µg/mL.

Mẫu thử T: cân chính xác một lượng bột thuốc khoảng 75 mg paracetamol vào

bình định mức 100 mL, thêm 25 mL dung dịch natri hydroxyd 0,1 N (TT) và 50 mL

nước, lắc 15 phút, thêm nước đến định mức. Lắc đều, lọc qua giấy lọc khô, bỏ 10 mL

dịch lọc đầu. Lấy chính xác 10 mL dịch lọc cho vào bình định mức 100 mL. Thêm

nước vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lấy chính xác 10 mL dung dịch trên cho vào bình định

mức 100 mL, thêm 10 mL dung dịch natri hydroxyd 0,1 N (TT), thêm nước đến định

mức, lắc đều.

Mẫu giả lập GL: tiến hành tạo mẫu giả định bằng cách cân tất cả các thành

phần trong công thức một viên ứng với 75 mg paracetamol. Mẫu giả định được xử lý

tương tự như mẫu thử T trước khi đo quang.

Mẫu giả dược GD: mẫu giả dược được tạo ra và xử lý tương tự mẫu giả lập GL

(ngoại trừ thành phần không có chứa paracetamol).

Mẫu trắng: dung dịch NaOH 0,01 N.

Tính đặc hiệu

Tiến hành: thẩm định tính đặc hiệu tiến hành trên 2 mẫu giả lập GL và giả

dược GD. Đo độ hấp thu của hai mẫu trên tại bước sóng 257 nm. Ghi nhận kết quả và

tính tỷ lệ giữa độ hấp thu của mẫu GD/GL.

Yêu cầu: quy trình định lượng đạt tính đặc hiệu khi tỷ lệ độ hấp thu của mẫu

GD/GL không quá 2%.

27

Khoảng tuyến tính và miền giá trị

Tiến hành: tiến hành pha dung dịch paracetamol chuẩn gốc có nồng độ khoảng

75 ppm. Từ đó, pha loãng dung dịch này thành các dung dịch chuẩn thứ cấp theo dãy

nồng độ 30 ppm; 15 ppm; 7,5 ppm; 3,75 ppm; 1,5ppm và 0,75 ppm.

Lần lượt đo độ hấp thu của các dung dịch chuẩn ở bước sóng 257 nm. Dựa

vàokết quả độ hấp thu, xác định phương trình hồi quy y = ax + b và hệ số tương quan

bình phương (r2).

Yêu cầu: r2 ≥ 0,995 quy trình đạt tính tuyến tính và miền giá trị xác định trong

khoảng tuyến tính khảo sát.

Độ chính xác

Tiến hành: chuẩn bị mẫu thử tương tự như ở mục xử lý mẫu (mẫu T). Thực

hiện với 6 mẫu độc lập. Tiến hành đo độ hấp thu các mẫu trên ở bước sóng 257 nm.

Ghi nhận kết quả độ hấp thu, tính toán hàm lượng paracetamol có trong từng mẫu và

RSD giữa 6 mẫu.

Yêu cầu: quy trình đạt độ chính xác khi kết quả định lượng paracetamol trên 6

mẫu có RSD ≤ 2%.

Độ đúng

Tiến hành: tạo các mẫu giả lập bằng cách thêm chuẩn paracetamol tương ứng

với 90, 100 và 110% vào mẫu tá dược. Mỗi mức hàm lượng thực hiện với 3 mẫu độc

lập. Cách xử lý mẫu tương tự mẫu thử T.

Xác định hàm lượng paracetamol bằng cách đo độ hấp thu ở bước sóng 257 nm.

Sau đó, tính tỷ lệ hồi phục bằng cách so sánh lượng paracetamol tính toán được với

lượng cân thực tế ban đầu.

Yêu cầu: quy trình phân tích đạt độ đúng khi tỷ lệ phục hồi ở từng nồng độ và

tỷ lệ phục hồi trung bình chung nằm trong giới hạn cho phép: 97 – 103%.

3.2.2.Quy trình định lượng paracetamol trong phép đo hòa tan

Điều kiện đo hòa tan:

– Thiết bị đo hòa tan: kiểu cánh khuấy (loại II theo USP 36).

– Thể tích môi trường: 900 mL.

– Môi trường hòa tan: môi trường pH khảo sát: 4,5.

– Nhiệt độ môi trường: 37 ± 0,5oC.

– Tốc độ cánh khuấy: 50 vòng/phút.

– Thời điểm lấy mẫu: 15 phút, 30 phút, 1 giờ, 2 giờ và 3 giờ.

– Thể tích lấy mẫu: 20 mL.

Xử lý mẫu:lọc dịch hòa tan qua giấy lọc thường, bỏ vài mL dịch lọc đầu, lắc đều. Rút

1 mL dịch lọc vào bình định mức 100 mL, bổ sung NaOH 0,1 N vừa đủ, lắc đều.

28

Mẫu trắng: dung dịch NaOH 0,1 N.

Tiến hành đo độ hấp thu các mẫu thử và mẫu chuẩn.

Thẩm định quy trình đo hòa tan

Tính đặc hiệu:quy trình đạt độ đặc hiệu khi độ hấp thu của mẫu giả dược so với

mẫu giả định tại các thời điểm khảo sát đều không quá 2% theo Sổ tay đăng kýthuốc –

Cục Quản lý Dược Việt Nam.

Tính tuyến tính: chuẩn bị dãy các dung dịch chuẩn có nồng độ 0,75 – 30 ppm.

Phương trình hồi quy đạt độ tuyến tính khi r2 ≥ 0,98 theo USP 36.

Độ đúng: cho vào mẫu thử một lượng chất chuẩn của chất cần thử có hàm

lượng bằng 50%, 80% và 100% hàm lượng ghi trên nhãn. Quy trình phân tích đạt độ

đúng khi tỉ lệ phục hồi ở từng mức nồng độ nằm trong giới hạn cho phép 95 – 105%

theo USP 36.

Độ chính xác: từ kết quả của độ đúng, tính RSD của các kết quả thu được ở

từng mức độ. Quy trình phân tích độ chính xác đạt khi giá trị thống kê độ hấp thu trên

3 mẫu/nồng độ có RSD ≤ 10% ở các thời điểm 15 phút, 30 phút, 1 giờ và 2 giờ, RSD ≤

5% ở thời điểm 3 giờ theo USP 36.

3.2.3. Khảo sát viên Tylenol trên thị trường

Tiến hành quét phổ mẫu chuẫn và Tylenol 650 mg Extended Release.

Pha mẫu như ở mục 3.2.1 tiến hành đo độ hấp thu ở bước sóng 257 nm. Xử lý

số liệu, xác định hàm lượng Tylenol 650 mg Extended Release.

29

CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ

4.1. QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG PARACETAMOL TRONG CHẾ PHẨM

Trước khi tiến hành thẩm định, ta khảo sát nguyên liệu paracetamol so với mẫu

chuẩn. Kết quả định tính nguyên liệu paracetamol được trình bày ở hình 4.1.

Hình 4.1. Kết quả định tính nguyên liệu paracetamol

4.1.1.Độ đặc hiệu

Phổ UV của mẫu chuẩn, mẫu giả lập và mẫu giả dược được trình bày ở hình 4.2.

Hình 4.2. Overlay phổ UV của mẫu giả dược, mẫu giả lập và mẫu chuẩn

QUÉT PHỔ CHUẨN

QUÉT PHỔ GIẢ DƯỢC

QUÉT PHỔ GIẢ LẬP

QUÉT PHỔ CHUẨN

QUÉT PHỔ NGUYÊN LIỆU

30

Qua đường biểu diễn độ hấp thu của mẫu giả lập và mẫu chuẩn so với mẫu giả

dược thể hiện rằng paracetamol cho đỉnh hấp thu đặc trưng ở bước sóng 257 nm. Như

vậy phương pháp định lượng paracetamol bằng phương pháp đo quang có tính đặc

hiệu.

Kết quả độ đặc hiệu được trình bày như ở bảng 4.1.

Bảng 4.1 Kết quả độ đặc hiệu

Độ hấp thu

Ảnh hưởng tá dược (%)

Mẫu giả dược Mẫu giả định

0,001 0,540 0,19

Nhận xét:

Tại bước sóng 257 nm, tá dược có hấp thu, nhưng độ hấp thu của tá dược với

mẫu giả định nhỏ hơn 2%. Vậy phương pháp phân tích cho phép xác định chính xác và

đặc hiệu hoạt chất paracetamol mà không bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của chất khác có

trong mẫu thử theo Sổ tay đăng ký thuốc – Cục Quản lý Dược Việt Nam.

4.1.2. Tính tuyến tính – miền giá trị

Sự biến thiên độ hấp thu theo nồng độ paracetamol được trình bày trong bảng

4.2 và hình 4.3.

Bảng 4.2. Sự biến thiên độ hấp thu theo nồng độ

Nồng độ (mg/l) 0,75 1,50 3,75 7,50 15,00 30,00

Độ hấp thu 0,051 0,103 0,266 0,539 1,075 2,149

Đ

ộ

h

ấ

p

t

h

u

y = 0.0717497x – 0.00240881

R² = 0.99999

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 5 10 15 20 25 30 35

Nồng độ (µg/mL)

31

Nhận xét:

Dựa trên đồ thị ta thấy khoảng nồng độ từ 0,75 – 30,00 mg/l có sự tuyến tính

giữa nồng độ và độ hấp thụ quang là rất tốt. Đồng thời so sánh hệ số tương quan R của

của Sổ tay đăng ký thuốc – Cục Quản lý Dược Việt Nam.

4.1.3.Độ chính xác

Kết quả độ chính xác được trình bày như ở bảng 4.3.

Bảng 4.3. Kết quả độ chính xác

Mẫu Độ hấp thu Nồng độ Hàm lượng (mg) % Hàm lượng Kết quả

1 0,533 7,46 648,30 99,74

SD = 1,7512 x 10-3

RSD = 0,3269%

2 0,535 7,49 650,16 100,02

3 0,536 7,50 650,29 100,04

4 0,537 7,52 651,28 100,20

5 0,535 7,49 650,16 100,02

6 0,538 7,53 650,66 100,10

Nhận xét: Độ lệch chuẩn tương đối RSD của 6 lần thử nhỏ hơn 2%. Vậy quy

trình phân tích đạt về độ chính xác theo Sổ tay đăng ký thuốc – Cục Quản lý Dược Việt

Nam.

4.1.4.Độ đúng

Kết quả độ đúng được trình bày như ở bảng 4.4.

Bảng 4.4. Kết quả độ đúng

Mẫu STT

Lượng chất chuẩn

thêm vào (mg)

Độ hấp thu

Lượng hoạt chất

tìm lại (mg)

Tỷ lệ

phục hồi (%)

90%

1 33,9 0,482 33,8 99,71

2 33,5 0,477 33,4 99,70

3 33,7 0,480 33,6 99,70

�̅� 99,70

RSD (%) 0,52

100%

1 37,3 0,525 36,8 98,66

2 37,8 0,535 37,5 99,21

3 37,6 0,531 37,2 98,94

�̅� 98,94

RSD (%) 0,95

110%

1 41,3 0,588 41,2 99,76

2 40,9 0,582 40,8 99,76

3 40,7 0,580 40,6 99,75

�̅� 99,76

RSD (%) 0,71

TRUNG BÌNH 99,47

RSD (%) 0,73

32

4.2. QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG PARACETAMOL TRONG PHÉP ĐO HÒA

TAN

4.2.1. Độ đặc hiệu

Kết quả độ đặc hiệu được trình bày như ở bảng 4.5.

Bảng 4.5. Kết quả độ đặc hiệu ở môi trường pH 4,5

Thời gian

Độ hấp thu Ảnh hưởng tá dược

(%) Mẫu giả dược Mẫu giả lập

15 phút 0,003 0,528 0,57

30 phút 0,003 0,535 0,56

1 giờ 0,006 0,538 1,12

2 giờ 0,008 0,542 1,48

3 giờ 0,008 0,551 1,45

Nhận xét:

Tại bước sóng 257 nm, tá dược có sự hấp thu, nhưng độ hấp thu của tá dược với

mẫu giả lập nhỏ hơn 2%. Vậy phương pháp phân tích cho phép xác định chính xác và

đặc hiệu hoạt chất paracetamol ở môi trường pH 4,5 mà không bị ảnh hưởng bởi sự có

mặt của chất khác có trong mẫu thử theo Sổ tay đăng ký thuốc – Cục Quản lý Dược

Việt Nam.

4.2.2. Tính tuyến tính

Môi trường pH 4,5

Sự biến thiên độ hấp thu theo nồng độ paracetamol ở môi trường pH 4,5 được

trình bày trong bảng 4.6 và hình 4.4.

Bảng 4.6. Sự biến thiên độ hấp thu theo nồng độ ở môi trường pH 4,5

Nồng độ (mg/l) 0,75 1,50 3,75 7,50 15,00 30,00

Độ hấp thu 0,052 0,104 0,266 0,538 1,079 2,161

Hình 4.4. Đồ thị khảo sát tính tuyến tính của paracetamol ở môi trường pH 4,5

y = 0.0721525x – 0.00357426

R² = 1

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 5 10 15 20 25 30 35

Đ

ộ

h

ấ

p

t

h

u

Nồng độ (µg/mL)

33

Nhận xét:

Dựa trên đồ thị ta thấy khoảng nồng độ từ 0,75 – 30,00 mg/l có sự tuyến tính

giữa nồng độ và độ hấp thụ quang là rất tốt. Đồng thời so sánh hệ số tương quan R của

36.

4.2.3.Độ chính xác

Kết quả độ chính xác được trình bày như ở bảng 4.7.

Bảng 4.7 Kết quả độ chính xác

Thời gian 15 phút 30 phút 1 giờ 2 giờ 3 giờ

Mẫu Độ hấp thu

1 0,527 0,532 0,536 0,542 0,550

2 0,526 0,533 0,537 0,540 0,551

3 0,527 0,533 0,537 0,542 0,548

4 0,528 0,534 0,536 0,541 0,550

5 0,528 0,533 0,538 0,542 0,547

6 0,527 0,531 0,535 0,539 0,549

RSD (%) 0,14 0,19 0,20 0,23 0,27

TRUNG BÌNH 0,206

Nhận xét: Độ lệch chuẩn tương đối RSD ở các thời điểm 15 phút, 30 phút, 1

giờ và 2 giờ nhỏ hơn 10%; ở thời điểm 3 giờ RSD < 5%. Vậy quy trình phân tích đạt

độ chính xác ở môi trường pH 4,5 theo USP 36.

4.2.4. Độ đúng

Kết quả độ đúng được trình bày như ở bảng 4.8.

Bảng 4.8. Kết quả độ đúng

Mẫu STT

Lượng chất

chuẩn thêm vào

(mg)

Độ hấp thu

Lượng hoạt

chất tìm lại

(mg)

Tỷ lệ phục

hồi (%)

50%

1 325,4 0,260 328,1 100,83

2 325,1 0,256 324,2 99,72

3 325,0 0,255 322,3 99,17

�̅� 99,91

RSD (%) 1,03

80%

1 520,2 0,416 523,8 100,69

2 520,1 0,415 521,9 100,35

3 519,9 0,413 519,0 99,83

�̅� 100,29

RSD (%) 0,37

100%

1 650,4 0,523 656,7 100,97

2 650,5 0,524 657,7 101,1

3 649,8 0,512 643,5 99,03

�̅� 100,46

RSD (%) 1,28

TRUNG BÌNH 100,22

RSD (%) 0,89

34

Nhận xét: Tỷ lệ phục hồi ở cả 3 mức nồng độ trong môi trường pH 4,5 nằm

trong khoảng 95 – 105%. Vậy quy trình phân tích đạt về độ đúng theoUSP 36.

4.3. KHẢO SÁT VIÊN TYLENOL

Tiến hành thử nghiệm viên Tylenol 650 mg Extended Release. Phổ mẫu chẩn

và phổ mẫu Tylenol Extended Release trình bày ở hình 4.5.

Hình 4.5. Overlay phổ UV của mẫu chuẩn và Tylenol 650 mg Extended Release

Nhận xét: Sau khi quét phổ thấy được đường phổ của mẫu Tylenol 650 mg

Extended Release gần với đường phổ của mẫu chuẩn.

Hàm lượng Tylenol Extended Release được trình bày ở bảng 4.9.

Bảng 4.9. Hàm lượng của viên Tylenol ở lô thử nghiệm

Mẫu Độ hấp thu Hàm lượng (mg) Hàm lượng viên (%)

1 0,529 648,4 99,75

2 0,529 648,4 99,75

3 0,528 647,4 99,60

4 0,528 647,4 99,60

5 0,528 647,4 99,60

6 0,532 649,7 99,95

KẾT QUẢ 99,71

QUÉT PHỔ CHUẨN

QUÉT PHỔ TYLENOL

35

CHƯƠNG 5. THẢO LUẬN

Nguyên liệu paracetamol đã được kiểm tra, định tính bằng cách chồng phổ UV –

Vis giữa mẫu nguyên liệu với mẫu chuẩn. Nguyên liệu có hàm lượng 99,72%

paracetamol. Đề tài đã tiến hành quy đổi lượng nguyên liệu để có được hàm lượng

paracetamol như đúng yêu cầu của hàm lượng viên.

5.1.THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG PARACETAMOL TRONG CHẾ

PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ UV-VIS

Sau khi tham khảo chuyên luận “viên nén paracetamol” trong Dược điển Việt

Nam IV, chúng tôi tiến hành điều chỉnh các bước sao cho phù hợp với điều kiện thực

nghiệm hiện có. Sau quá trình khảo sát, đánh giá thực nghiệm cho thấy quy trình phù

hợp, đáp ứng được yêu cầu định lượng viên nén paracetamol 650 mg PTKD. Chúng

tôi đã tiến hành thẩm định quy trình định lượng đã thiết kế theo Sổ tay đăng ký thuốc –

Cục Quản lý Dược Việt Nam.

5.1.1.Độ đặc hiệu

Để chứng minh được quy trình định lượng có tính chọn lọc cao hay nói cách

khác là các yếu tố khác (nếu có) như tá dược, dung môi không ảnh hưởng hoặc ảnh

hưởng không đáng kể đến kết quả định lượng paracetamol. Chúng tôi tiến hành song

song hai mẫu: mẫu giả dược (có thành phần giống như công thức nhưng không có

paracetamol) và mẫu giả lập (có thành phần hoàn toàn giống với công thức bao gồm cả

paracetamol). Tiến hành xử lý mẫu và đo độ hấp thu trong cùng điều kiện. Kết quả cho

thấy rằng tại cực đại hấp thu của paracetamol 257 nm thì mẫu giả dược vẫn có hấp thu.

Tuy nhiên, độ hấp thu này so với mẫu giả lập là không quá 2% đáp ứng theo yêu cầu

của Sổ tay đăng ký thuốc – Cục Quản lý Dược Việt Nam. Như vậy, quy trình đã đạt

độc đặc hiệu.

5.1.2.Tính tuyến tính

So sánh hệ số tương quan R của đồ thị và giới hạn hệ số tương quan ta thấy

Việt Nam. Do đó có thể dùng phương trình hồi quy y = 0.0717497x – 0.00240881 để

định lượng paracetamol 650 mg PTKD ở khoảng nồng độ 0,75 – 30,00 mg/l.

5.1.3.Độ chính xác

Kết quả 6 lần định lượng cho RSD ≤ 2% nằm trong giới hạn cho phép theo quy

định của Sổ tay đăng ký thuốc – Cục Quản lý Dược Việt Nam, cho thấy sự lặp lại trong

thao tác của người phân tích.

5.1.4.Độ đúng

Quy trình định lượng cho kết quả tỷ lệ hồi phục ở mỗi nồng độ riêng biệt 90%,

100%, 110% và tỷ lệ hồi phục trung bình đều nằm trong giới hạn yêu cầu từ 97,0 –

36

103,0% của Sổ tay đăng ký thuốc – Cục quản lý Dược Việt Nam. Như vậy, quy trình

đảm bảo được tính nguyên vẹn của mẫu, trong quá trình pha mẫu khảo sát, hàm lượng

hoạt chất đã mất đi không đáng kể do thao tác hoặc bị giữ lại trên vật liệu lọc.

5.2. QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG PARACETAMOL TRONG PHÉP ĐO HÒA

TAN

Theo FDA, thử nghiệm độ hòa tan in vitro được áp dụng cho các chế phẩm

phân liều dạng rắn nhằm xác định lượng hoạt chất hòa tan trong môi trường lỏng cóthể

tích nhất định, trong khoảng thời gian định trước, sử dụng các thiết bị chuyên

biệtnhằmkiểm soát một cách thận trọng các thông số của thử nghiệm độ hòa tan.

Đề tài đã tham khảo điều kiện đo hòa tan cho viên nén paracetamol trong Dược

điển Việt Nam IV và chuyên luận “viên nén phóng thích kéo dài acetaminophen” trong

USP 36. Chúng tôi tiến hành điều chỉnh các bước sao cho phù hợp với điều kiện thực

nghiệm hiện có. Sau quá trình khảo sát, đánh giá thực nghiệm cho thấy quy trình phù

hợp, đáp ứng được yêu cầu định lượng trong phép đo độ hòa tan của viên nén

paracetamol 650 mg PTKD.

Có nhiều hướng dẫn về thẩm định quy trình định lượng (bao gồm định lượng

cho phép đo hòa tan), nhưng chỉ có hướng dẫn của USP là cụ thể và riêng biệt cho đo

hòa tan. Tuy cách tiến hành theo hướng dẫn của USP phức tạp hơn so với các hướng

dẫn khác như ICH, FDA hay Sổ tay đăng ký thuốc – Cục Quản lý Dược Việt Nam

nhưng khoảng yêu cầu cho phép rộng hơn. Trong phép đo hòa tan có rất nhiều yếu tố

ảnh hưởng đến kết quả như hoạt chất, tá dược, quá trình sản xuất, tình trạng viên khi

đo, viên dính vào thành cốc, tốc độ cánh khuấy hay sự phân tán của hoạt chất trong

môi trường đo hòa tan. Tất cả yếu tố kể trên ảnh hưởng đến kết quả đo hòa tan rất

nhiều và do đó mà độ lặp lại trong kết quả đo hòa tan thấp. Khoảng cho phép rộng hơn

theo USP giúp cho quá trình thẩm định dễ dàng hơn. Chính vì thế, đề tài này tiến hành

thẩm định quy trình định lượng paracetamol trong phép đo độ hòa tan theo USP.

5.2.1. Độ đặc hiệu

Để chứng minh được quy trình định lượng có tính chọn lọc cao hay nói cách

khác là các yếu tố khác (nếu có) như tá dược, dung môi pha mẫu hay môi trường hòa

tan không ảnh hưởng hoặc ảnh hưởng không đáng kể đến kết quả định lượng

paracetamol. Chúng tôi tiến hành đo độ hòa tan song song hai mẫu ở môi trường pH

4,5: mẫu giả dược và mẫu giả lập. Tiến hành xử lý mẫu và đo độ hấp thu ở từng thời

điểm khảo sát (15 phút, 30 phút, 1 giờ, 2 giờ và 3 giờ) trong cùng điều kiện. Kết quả

cho thấy rằng cực đại hấp thu của paracetamol tại 257 nm thì mẫu giả dược vẫn có hấp

thu. Tuy nhiên, độ hấp thu này so với mẫu giả lập là không quá 2% đáp ứng theo yêu

cầu của Sổ tay đăng ký thuốc – Cục Quản lý Dược Việt Nam. Như vậy, quy trình đã

đạt độ đặc hiệu.

37

5.2.2 Tính tuyến tính

Viên nén paracetamol 650 mg PTKD có mức độ giải phóng hoạt chất tại thời

điểm đầu là khoảng 50% và thời điểm cuối là khoảng gần 100%. Đối với tính tuyến

tính và miền giá trị trong phép đo độ hòa tan thì yêu cầu phải xây dựng rộng hơn

±20% so với nồng độ thấp nhất và cao nhất tức là trong phép đo độ hòa tan này phải

xây ít nhất là từ 30% – 120%.

So sánh hệ số tương quan R của đồ thị và giới hạn hệ số tương quan ta thấy

y=0.0721525x – 0.00357426 để định lượng paracetamol 650 mg PTKD ở khoảng nồng

độ 0,75 – 30,00 mg/l.

5.2.3.Độ chính xác

Kết quả 6 lần định lượng sau các khoảng thời gian đều cho RSD ≤ 5% nằm trong

giới hạn cho phép theo quy định của USP 36, cho thấy sự lặp lại trong thao táccủa

người phân tích.

5.2.4. Độ đúng

Quy trình định lượng cho kết quả tỷ lệ hồi phục ở mỗi nồng độ riêng biệt 50%,

80%, 100% và tỷ lệ hồi phục trung bình đều nằm trong giới hạn yêu cầu từ 95,0 –

105,0% của USP 36. Như vậy, quy trình đảm bảo được tính nguyên vẹn của mẫu,

trong quá trình pha mẫu khảo sát, hàm lượng hoạt chất đã không bị mất đi đáng kể do

thao tác hoặc bị giữ lại trên vật liệu lọc.

5.3.KHẢO SÁT VIÊN TYLENOL TRÊN THỊ TRƯỜNG

Viên đạt tất cảchỉ tiêu chất lượng đề ra như hình thức cảm quan, định tính, định

lượng. Hàm lượng paracetamol trong viên đạt so với yêu cầu chỉ tiêu chất lượng.

Độ lặp lại và hàm lượng paracetamol trong viên Tylenol trong lô thử nghiệm

được trình bày ở bảng 5.1.

Bảng 5.1. Khảo sát độ lặp lại và hàm lượng paracetamol trong viên Tylenol 650 mg

Extended Release

Mẫu Độ hấp thu Hàm lượng (mg) Hàm lượng viên (%)

1 0,529 648,4 99,75

2 0,529 648,4 99,75

3 0,528 647,4 99,60

4 0,528 647,4 99,60

5 0,528 647,4 99,60

6 0,532 649,7 99,95

KẾT QUẢ

SD = 1,5492 x 10-3

RSD = 0,2929%

99,71

Kết quả cho thấy rằng phương pháp UV – Vis có thể giúp định lượng chính xác

và sát gần với giá trị thực hàm lượng paracetamol trong dịch hòa tan mà không bị ảnh

38

hưởng bởi các tá dược. Như vậy, có thể sử dụng quy trình đã thẩm định để tiến hành

định lượng paracetamol trong phép đo độ hòa tan.

Cả hai phương pháp định lượng trong chế phẩm và trong độ hòa tan viên nén

paracetamol phóng thích kéo dài đều sử dụng phương pháp UV – Vis. Với các số liệu

chứng minh trong thẩm định quy trình phân tích cho phép phương pháp có thể áp dụng

để định lượng. Mặt khác, phương pháp này có nhiều ưu điểm: đơn giản, tiện lợi, cho

kết quả nhanh chóng, chính xác và tiết kiệm chi phí.

39

CHƯƠNG 6. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

6.1.KẾT LUẬN

Sau một thời gian thực nghiệm thẩm định quy trình định lượng paracetamol 650

mg bằng phương pháp quang phổ UV – Vis đã thu được một số kết quả sau:

Phương pháp định lượng trong chế phẩm đạt về các yêu cầu theo Sổ tay đăng ký

thuốc – Cục Quản lý Dược Việt Nam:

– Độ đặc hiệu: quy trình định lượng có tính chọn lọc cao (độ hấp thu của mẫu giả

dược so với mẫu giả lập không quá 2%).

– Tính tuyến tính: xây dựng được phương trình hồi quy với hệ số tuyến tính cao

– Độ lặp lại: sai số tương đối (hoặc độ lệch chuẩn tương đối) đạt ≤ 2%.

– Độ đúng: khả năng tìm lại nằm trong khoảng 97 – 103%.

Phương pháp định lượng trong phép đo hòa tan đạt về các yêu cầu theoUSP 36:

– Độ đặc hiệu: độ hấp thu của mẫu giả dược so với mẫu giả lập không quá 2%.

– Tính tuyến tính: xây dựng được phương trình hồi quy với hệ số tuyến tính cao

– Độ lặp lại: đạt ở các thời điểm 15 phút, 30 phút, 1 giờ và 2 giờ RSD < 10%, 3

giờ RSD < 5%.

– Độ đúng: khả năng tìm lại nằm trong khoảng 95 – 105%.

Phương pháp quang phổ có nhiều ưu điểm:

– Đơn giản.

– Tiện lợi.

– Cho kết quả nhanh chóng.

– Chính xác.

– Tiết kiệm chi phí.

6.2.KIẾN NGHỊ

Dựa trên các kết quả đạt được chúng tôi có một số kiến nghị như sau:

– Do quá trình làm, thiết bị có trục trặc nên cần tiếp tục khảo sát các khoảng thời

gian giải phóng bao nhiêu phần trăm dược chất ở phép đo hòa tan.

– Cần tiến hành định lượng ở những môi trường khác.

– Cần tiến hành định lượng trên nhiều mẫu hơn nữa nhằm đạt độ chính xác cao

hơn.

– Ngày nay, với sự tiến bộ không ngừng của khoa học nên có nhiều phương pháp

để thẩm định quy trình định lượng paracetamol như:

 Phương pháp HPLC.

 Phương pháp sắc ký khí.

40

 Phương pháp cực phổ.

Từ đó tăng tính chính xác hơn cho quá trình kiểm nghiệm dược phẩm, góp phần

làm giảm sự lưu hành thuốc giả, thuốc kém chất lượng nhằm mang lại lợi ích cho

người tiêu dùng.

41

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt, Tiếng Anh

1. Bộ môn Bào chế – Trường Đại học Dược Hà Nội (2005). Một số chuyên đề về bào

chế hiện đại. Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.

2. Bộ Y tế (2007). Bào chế và sinh dược học tập 2. Nhà xuất bản Giáo dục, Hà Nội.

3. Bộ Y tế (2009). Dược điển Việt Nam IV.

4. Bộ Y tế (2011). Kiểm nghiệm thuốc. Nhà Xuất Bản Giáo Dục Việt Nam, Hà Nội.

5. Bộ Y tế (2012). Dược thư quốc gia Việt Nam.

6. Bộ Y tế (2013). Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc – phụ lục 8: Thẩm định phương

pháp phân tích.

7. Dhopeshwarkar, V. and Zatz, J.L. (1993). “Evaluation of xanthan gum in the

pparation of sustained release matrix tablets”. Drug Delivery, 19(9). p. 999-

1017.

8. Dipti Phadtare (2015). “Extend release formulation of BCS class i drugs”, World

Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 4(04). p. 1676-1688.

9. Đặng Văn Giáp (2012). Phân tích dữ liệu trong kiểm nghiệm. Đại học Y Dược Tp.

Hồ Chí chúng tôi 51-56.

10. Hoàng Ngọc Hùng (2012). Tá dược và chất phụ gia dùng trong dược phẩm, mỹ

phẩm và thực phẩm. Nhà xuất bản Y Học, Hà Nội.

11. Lê Quan Nghiệm (2007). Sinh dược học và các hệ thống trị liệu mới. NXB Y

học.tr. 50-60, 178-209.

12. Mohhamad Hosain, JamesWW. Ayres (1996). “Relative bioavailability of a novel

sustained release acetaminophen mold tablets”. International Journal of

Pharmaceutical, Volume 133, p. 223-235.

13. Nguyễn Lầu Hai (2014). Xây dựng quy trình định lượng Cephalexin trong dược

phẩm bằng phương pháp quang phổ UV – Vis. Luận văn tốt nghiệp ngành Hóa

học. Trường Đại Học Cần Thơ.

14. Nguyễn Thị Diệp Chi (2008). Bài giảng kiểm nghiệm thực phẩm và dược phẩm.

Đại học Cần Thơ, Tp. Cần Thơ.

15. Robert B. Raffa (2005). Analgensis, Antipyretic and anti-inflamatory Drug,

Remington: The science and practice in pharmacy, 21th edition. pp. 1541-1542.

16. The United States Pharmacopeial Convention (2013). The United States

Pharmacopeia 36 – National Formulary 31.

17. Trần Thanh Đức (2012). Định lượng paracetamol trong một số dược phẩm trên địa

bàn thành phố Cần Thơ bằng phương pháp UV – Vis. Luận văn tốt nghiệp Đại

học. Trường Đại Học Cần Thơ.

18. Trần TửAn (2005). Kiểm nghiệm dược phẩm. Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.

42

19. Trần Tứ Hiếu (2008). Phân tích trắc quang phổ hấp thụ UV-Vis. Tái bản lần 2. Hà

Nội. NXB Đại học Quốc gia Hà Nội.

20. Trần Thị Thu Hằng (2014). Dược Lực Học. Nhà xuất bản Phương Đông.tr. 199-

200.

21. Trần Cao Sơn, Phạm Xuân Đà, Lê Thị Hồng Hảo và Nguyễn Thành Trung (2010).

Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật. Nhà Xuất bản

Khoa học và Kỹ thuật. Viện kiểm nghiệm vệ sinh an toàn thực phẩm quốc gia Hà

Nội.

22. Võ Thùy Ngân (2008). Nghiên cứu kỹ thuật và quy trình bào chế viên PTKD chứa

diltiazem 90 mg. Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ dược học. Trường Đại Học Y Dược

Tp. Hồ Chí Minh.

Website

23.Andrew D. Trafford, Roger D. Jee và các cộng sự (1999). A rapid quantitative

assay of intact paracetamol tablets by reflectance near-infrared spectroscopy.

t. Access 15 May 2022.

24. Lê Nhất Tâm (2014). UV-Visiple Spectrophotometer.

https://www.slideshare.net/nhattamnhattam/ph-uv-vis. Truy cập ngày 20.05.2017

25. Ramesh Sawant, Lokesh Bhangale và các cộng sự (2010). Validated

spectrophotometric methods for simultaneous estimation of Paracetamol,

Domperidone and Tramadol HCl in pure and tablet dosage form.

origsite=gscholar&cbl=2042709. Access 15 May 2022

43

PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Thẩm định quy trình phân tích theo USP

Loại quy trình phân tích

Loại

1

Loại 2 Loại

3

Loại

4 Định lượng tạp Giới hạn tạp

Độ đúng + + * * –

Độ chính xác + + – – –

Tính đặc hiệu + + + * +

Giới hạn phát hiện – – + * –

Giới hạn định lượng – + – * –

Tính tuyến tính + + – * –

Miền giá trị + + * * –

*: có thể được thẩm định tùy thuộc vào yêu cầu của mỗi quy trình.

Loại 1: định lượng nguyên liệu hay thành phẩm chính của thuốc.

Loại 2: xác định tạp chất trong nguyên liệu hay sản phẩm phân hủy trong thuốc.

Loại 3: định lượng hoạt chất phóng thích trong đo độ hòa tan.

Loại 4: định tính.

44

Phụ lục 2: Độ hấp thụ của mẫu giả lập, giả dược ở bước sóng 257 nm khi khảo

sát độ đặc hiệu

45

Phụ lục 3: Khảo sát tính tuyến tính ở bước sóng 257 nm

46

Phụ lục 4: Độ hấp thụ của mẫu khi khảo sát độ chính xác tại bước sóng 257 nm

47

Phụ lục 5: Độ hấp thụ của mẫu thêm chuẩn hàm lượng 90% khi khảo sát độ đúng

48

Phụ lục 6: Độ hấp thụ của mẫu thêm chuẩn hàm lượng 100% khi khảo sát độ

đúng

49

Phụ lục 7: Độ hấp thụ của mẫu thêm chuẩn hàm lượng 110% khi khảo sát độ

đúng

50

Phụ lục 8: Độ hấp thụ của mẫu giả lập, giả dược ở bước sóng 257 nm khi khảo sát

độ đặc hiệu trong đo độ hòa tan

51

Phụ lục 9: Khảo sát tính tuyến tính ở bước sóng 257 nm trong đo độ hòa tan

52

Phụ lục 10: Độ hấp thụ của mẫu sau 15 phút khi khảo sát độ chính xác tại bước

sóng 257 nm trong đo độ hòa tan

53

Phụ lục 11: Độ hấp thụ của mẫu sau 30 phút khi khảo sát độ chính xác tại bước

sóng 257 nm trong đo độ hòa tan

54

Phụ lục 12: Độ hấp thụ của mẫu sau 1 giờ khi khảo sát độ chính xác tại bước sóng

257 nm trong đo độ hòa tan

55

Phụ lục 13: Độ hấp thụ của mẫu sau 2 giờ khi khảo sát độ chính xác tại bước sóng

257 nm trong đo độ hòa tan

56

Phụ lục 14: Độ hấp thụ của mẫu sau 3 giờ phút khi khảo sát độ chính xác tại

bước sóng 257 nm trong đo độ hòa tan

57

Phụ lục 15: Độ hấp thụ của mẫu thêm chuẩn hàm lượng 50% khi khảo sát độ

đúng trong đo độ hòa tan

58

Phụ lục 16: Độ hấp thụ của mẫu thêm chuẩn hàm lượng 80% khi khảo sát độ

đúng trong đo độ hòa tan

59

Phụ lục 17: Độ hấp thụ của mẫu thêm chuẩn hàm lượng 100% khi khảo sát độ

đúng trong đo độ hòa tan

60

Phụ lục 18: Độ hấp thụ của mẫu Tylenol 650 mg Extended Release

Các file đính kèm theo tài liệu này:

• doan_nguyen_ho_thien_nhi_491_2083105.pdf

--- Bài cũ hơn ---

--- Bài mới hơn ---

Hiệu suất quang học vượt trội của máy đo quang phổ UV Vis Excellence của METTLER TOLEDO tuân thủ các tiêu chuẩn nghiêm ngặt của ngành dược phẩm; gi…

Hiệu suất quang học vượt trội của máy đo quang phổ UV Vis Excellence của METTLER TOLEDO tuân thủ các tiêu chuẩn nghiêm ngặt của ngành dược phẩm; giao diện trực quan, các phương pháp được xác định trước và phép đo màu đều có trong một thiết bị nhỏ gọn, bền chắc. Sự kết hợp giữa công nghệ Array và nguồn sáng Xenon có tuổi thọ cao cho phép quét toàn bộ phổ chỉ trong vài giây và giảm đáng kể chi phí bảo trì. Tận hưởng hoạt động linh hoạt của một thiết bị độc lập, hoặc mở rộng không gian bàn làm việc của bạn với phần mềm máy tính LabX® để đảm bảo tính toàn vẹn dữ liệu, và kết nối các hệ thống đa thông số với các thiết bị khác của METTLER TOLEDO.

Máy đo quang phổ thể tích siêu nhỏ

UV5Nano là máy đo quang phổ thể tích siêu nhỏ chuyên dụng dùng để thực hiện các phép đo thể tích siêu nhỏ chính xác và có thể lặp lại chỉ với 1 µL mẫu. Công nghệ LockPath™ ngăn ngừa mẫu khô và cho phép đo phạm vi nồng độ rộng. Thiết bị nhỏ gọn và mạnh mẽ này tập trung vào các ứng dụng đo quang phổ khoa học sự sống, cung cấp cả phép đo cuvet và thể tích siêu nhỏ trên thiết bị độc lập, hoặc bằng phần mềm máy tính LabX®.

Phần mềm LabX® UV Vis

Phần mềm máy tính LabX® UV Vis bổ sung tính linh hoạt cho quy trình làm việc và hỗ trợ tuân thủ các quy định của FDA như 21 CFR Phần 11. Sự kết hợp của LabX® và máy đo quang phổ Excellence giúp hoàn toàn điều chỉnh các hệ thống tổng hợp UV Vis cho quy trình làm việc trong phòng thí nghiệm. Giải pháp phòng thí nghiệm thực hiện các phép tính, báo cáo và quản lý dữ liệu, tiết kiệm thời gian cho người vận hành cũng như quản lý phòng thí nghiệm, đồng thời loại bỏ nguy cơ xảy ra lỗi xử lý dữ liệu.

Các ứng dụng đo quang phổ UV Vis

Máy đo quang phổ UV Vis Excellence có thể được sử dụng trong nhiều ngành công nghiệp. Tuân thủ các quy định nghiêm ngặt trong ngành Dược phẩm và Mỹ phẩm với máy đo quang phổ UV7, mang lại hiệu suất quang học vượt trội và cùng với phần mềm máy tính LabX®, đảm bảo tính toàn vẹn dữ liệu và tuân thủ theo quy định. Các ngành Khoa học sự sống và Công nghệ sinh học có thể tăng hiệu suất từ các phương pháp được xác định trước của máy đo quang phổ UV5Bio và UV5Nano. Các ngành yêu cầu công suất cao có thể tự động hóa quy trình làm việc của họ và đo tới 303 mẫu với bộ lấy mẫu tự động InMotion.

Hãy truy cập Thư viện ứng dụng đo quang phổ UV Vis của chúng tôi và bổ sung kiến thức từ các ghi chú ứng dụng đã được kiểm chứng và kiểm tra kỹ lưỡng về phép đo quang phổ UV/VIS.

Các tài liệu, hội thảo trực tuyến, tài liệu kỹ thuật và video về phép đo quang phổ UV Vis đều có sẵn trong Thư viện chuyên môn của chúng tôi

--- Bài cũ hơn ---

--- Bài mới hơn ---

Vitamin C (acid ascorbic) là 1 chất chống oxy hóa cần thiết đối với dinh dưỡng của con người. Thiếu vitamin C có thể dẫn đến bệnh scurvy (scobat) đặc trưng khiến cho xương và răng không bình thường. Rất nhiều trái cây và rau quả chứa vitamin C, nhưng việc chế biến món ăn đã làm mất đi hàm lượng vitamin C, vì vậy, trái cây tươi loại cam quýt và nước uống của chúng là nguồn cung cấp chủ yếu acid ascorbic cho cơ thể.

1 phương pháp xác định hàm lượng vitamin C trong thực phẩm là sử dụng phương pháp khử oxy hóa. Phản ứng khử oxy hóa tốt hơn phương pháp chuẩn độ acid-baz bởi vì cho thêm acid vào nước quả, nhưng một số acid sẽ cản trở sự oxy hóa acid ascorbic bởi iốt.

Iốt tương đối không tan trong nước, nhưng điều này có thể cải thiện bằng cách pha trộn iốt với iođua và hình thành triiođua:

Triiođua oxy hóa vitamin C tạo acid dehydroascorbic:

Chừng nào mà vitamin C còn hiện diện trong dung dịch, thì triiođua được chuyển thành ion iođua rất nhanh chóng.

Tuy nhiên, khi tất cả vitamin C đã bị oxy hóa, thì iốt và triiođua sẽ hiện diện trong dung dịch và phản ứng với tinh bột tạo nên một hỗn hợp màu xanh đen. Màu xanh đen là điểm dừng cho phản ứng chuẩn độ.

Quy trình chuẩn độ này thích hợp trong việc kiểm tra hàm lượng vitamin C trong viên thuốc vitamin C, nước ép quả, và trái cây tươi, đông lạnh hoặc trái cây đóng gói và rau quả. Phương pháp chuẩn độ có thể thực hiện chỉ sử dụng dung dịch iốt và không dùng iodate, nhưng dung dịch iodate ổn định hơn và cho kết quả chính xác hơn.

acid ascorbic

Mục đích của thí nghiệm này là xác định hàm lượng vitamin C trong các mẫu thử, ví dụ nước ép quả.

Dung dịch chỉ thị 1% tinh bột:

1. Cho 0,5 g tinh bột hòa tan vào 50 ml nước cất nóng gần sôi.

2. Hòa tan hoàn toàn và để dung dịch nguội trước khi sử dụng. (không phải lúc nào cũng là dung dịch hồ tinh bộ 1%, dung dịch 0,5% cũng tốt).

1. Hòa tan 5 g KI và 0,268 g KIO 3 trong 200 ml nước cất.

2. Thêm 30 ml acid sunfuric 3 M.

3. Cho dung dịch này vào ống đong 500 ml và pha loãng dung dịch bằng nước cất đến vạch định mức 500 ml.

4. Hòa tan dung dịch hoàn toàn.

5. Cho dung dịch vào becher 600 ml.

Ghi nhãn trên becher là “dung dịch iốt”.

Dung dịch vitamin C chuẩn:

1. Hòa tan 0,250 g vitamin C (acid ascorbic) trong 100 ml nước cất.

2. Dùng nước cất pha loãng thành dung dịch 250 ml bằng bình định mức. Ghi nhãn trên bình là “dung dịch vitamin C chuẩn”.

Tiêu chuẩn hóa các dung dịch:

1. Thêm 25,00 ml dung dịch chuẩn vitamin C vào bình erlen 125 ml.

2. Thêm 10 giọt dung dịch hồ tinh bột 1 %.

3. Rửa sạch buret với một lượng nhỏ dung dịch iốt và sau đó cho dung dịch iốt vào buret. Ghi lại vạch thể tích dung dịch ban đầu trong buret.

4. Chuẩn độ dung dịch cho đến điểm dừng phản ứng, khi bạn thấy dấu hiệu đầu tiên của màu xanh dương bền trong 20 giây khi bạn lắc đều dung dịch.

5. Ghi nhận vạch thể tích dung dịch iốt trên buret. Lượng iốt đã dùng cho chuẩn độ chính là thể tích dung dịch iốt ban đầu trừ đi dung dịch sau chuẩn độ.

6. Làm lại thí nghiệm chuẩn độ ít nhất 2 lần. Các kết quả chấp nhận sai khác 0,1 ml.

Tiến hành chuẩn độ các mẫu thí nghiệm tương tự quá trình chuẩn độ dung dịch vitamin C chuẩn. Nhớ ghi nhận lại thể tích dung dịch iốt ban đầu và sau khi chuẩn độ cho đến khi xuất hiện điểm dừng làm thay đổi màu dung dịch.

Chuẩn độ các mẫu nước ép quả:

1. Cho 25,00 ml nước ép quả vào erlen 125 ml.

2. Chuẩn độ cho đến khi xuất hiện điểm dừng phản ứng. (Cho dung dịch iốt cho đến khi màu xanh xuất hiện bền trong 20 giây)

3. Lặp lại chuẩn độ cho đến khi có 3 kết quả sai số 0,1 ml.

Chuẩn độ nước chanh:

Chanh dễ dùng cho thí nghiệm chuẩn độ vì chứa nhiều vitamin C.

1. Cho 10,00 ml nước chanh vào erlen 125 ml.

2. Chuẩn độ cho đến khi được 3 kết quả dung dịch iốt sai số 0,1 ml.

Viên thuốc vitamin C – hòa tan viên thuốc vào khoảng 100 ml nước cất. Cho thêm nước cất vào để thành dung dịch 200 ml trong 1 ống đong.

• Nước ép quả – lọc nước ép quả bằng giấy lọc hay miếng vải thưa để tách bã và hạt, bởi vì chúng có thể làm nghẹt trong các vật dụng thí nghiệm bằng thủy tinh.
• Nước ép quả đóng hộp – cũng phải đem lọc.
• Trái cây và rau quả – Xay nhỏ 100 g với 50 ml nước cất. Lọc dung dịch. Thấm ướt giấy lọc bằng vài ml nước cất. Thêm nước cất để thu dung dịch 100 ml trong bình định mức.

Chuẩn độ các mẫu này tương tự như mẫu nước quả trên.

Tính toán nồng độ vitamin C:

Các phép tính chuẩn độ:

1. Tính toán thể tích dung dịch iốt dùng cho mỗi mẫu. Tính trung bình các mẫu:

Thể tích trung bình = thể tích tổng cộng / số lần tiến hành thí nghiệm chuẩn độ

2. Xác định thể tích iốt chuẩn độ cho dung dịch vitamin C chuẩn:

Nếu bạn có trung bình 10,00 ml dung dịch iốt phản ứng với 0,250 g vitamin C, thì có thể xác định hàm lượng vitamin C trong mẫu. Ví dụ, nếu có 6,00 ml dung dịch iốt phản ứng với nước quả:

10,00 ml dung dịch iốt / 0,250 g vitamin C = 6,00 ml dung dịch iốt / X ml vitamin C

X = 0,15 g vitamin C hiện diện trong mẫu thử.

3. Ghi nhớ thể tích của mẫu, để có thể làm phép tính khác, như g/l. Ví dụ, đối với 25 ml nước quả:

0,15 g / 25 ml = 0,15 g / 0,025 l = 6,00 g/l vitamin C trong mẫu thử.

--- Bài cũ hơn ---

--- Bài mới hơn ---

Nhưvậy, nếu không yêu cầu độchính xác cao, có thểdùng phương

pháp đo quang phổhấp thụUV-VIS theo DĐVN III để định lượng berberin

nguyên liệu (đạt yêu cầu về giới hạn tạp chất palmatin không quá 2%) vì

phương pháp này không tốn kém, tiến hành nhanh, thao tác đơn giản, dễthực

hiện. Với thành phẩm do không quy định hàm lượng palmatin và những tạp

khác cũng có thểhấp thụUV nên đểcó kết quả định lượng chính xác thì nên

dùng phương pháp HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005).

* Tiến hành:

9

Lần lượt tiêm các dung dịch thử và chuẩn. Dựa vào đáp ứng của pic

berberin trong dung dịch thử, chuẩn và hàm lượng dung dịch chuẩn, tính

lượng berberin cĩ trong chế phẩm.

 Phương pháp 3:

1.3.2. Cơ sở lý thuyết

Quá trình phân tách trong kỹ thuật HPLC là do quá trình vận chuyển và

phân bố của các chất tan giữa 2 pha khác nhau. Khi pha động di chuyển với

10

một tốc độ nhất định qua cột sắc ký sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh lưu giữ ra

khỏi cột. Tùy theo bản chất pha tĩnh, chất tan và dung mơi mà quá trình rửa

giải tách được các chất khi ra khỏi cột sắc ký. Nếu ghi quá trình tách sắc ký,

chúng ta cĩ sắc đồ.

1.3.3. Các thơng số đặc trưng của quá trình sắc ký:

Kết quả của quá trình sắc kí được detector phát hiện, phĩng đại và ghi

thành sắc ký đồ( hình 1):

Hình 1: sắc ký đồ của 2 chất và các thơng số đặc trưng

Trong đĩ :

to (thời gian chết): Là thời gian cần thiết để pha động chảy qua cột tách

tR (thời gian lưu): thời gian kể từ khi chất cần phân tích được bơm vào

cột cho đến khi xuất hiện đỉnh của pic chất cần phân tích.

tR’ (thời gian lưu thực ) = tR- to.

W0,5: Độ rộng pic ở nửa chiều cao

Wb: Độ rộng đáy pic.

1.3.2.1. Hệ số dung lượng k’

, , .

1.3.2.5. Số đĩa lý thuyết N

Đặc trưng cho hiệu lực cột.

12

N = 16 











w

t

B

R

2

hay N=5,54 











w

t

B2/1

R

2

Nếu gọi L là chiều cao cột sắc ký, thì chiều cao của đĩa lý thuyết H

được tính bằng cơng thức: =H

N

L

1.3.4. Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC

Hệ thống HPLC đơn giản và đủ để làm việc theo kỹ thuật HPLC bao

gồm 6 bộ phận chính sau:

a/Hệ thống bơm

Để bơm pha động vào cột tách. Bơm này phải điều chỉnh được áp suất

(0 – 400 bar)

a/ Bình chứa dung mơi và hệ thống xử lý dung mơi

Bình chứa dung mơi thường bằng thủy tinh hoặc thép khơng gỉ. Dung

mơi chạy sắc ký được lọc qua màng lọc (thường màng lọc cỡ lỗ 0,45 µm ) và

đuổi khí hịa tan.

c/ Hệ tiêm mẫu

Để đưa mẫu phân tích vào cột.

Cĩ nhiều phương pháp tiêm mẫu khác nhau, đơn giản nhất là sử dụng

một van tiêm. Trong các hệ thống sắc ký hiện đại là hệ tiêm mẫu tự động.

Trong sắc ký lỏng, mẫu lỏng cĩ thể được tiêm ngay sau khi lọc loại tạp

qua màng lọc 0,45 µm, cịn mẫu rắn cần hịa tan trong 1 dung mơi

thích hợp.

d/ Cột sắc ký lỏng HPLC

Cột được chế tạo bằng thép đặc biệt trơ với hĩa chất, chịu được với áp

suất cao đến vài trăm bar.

– Chiều dài cột: 10, 15, hoặc 25 cm; thích hợp với các tiểu phân pha

tĩnh cĩ đường kính rất nhỏ (3, 5, 10 µm).

– Đường kính cột: 4 hoặc 4,6 mm.

13

e/ Detector trong HPLC

Là bộ phận phát hiện chất phân tích, tùy theo bản chất của chất cần

phân tích mà sử dụng detector thích hợp. Detector hay sử dụng là detector hấp

thụ UV – VIS. Ngồi ra cịn cĩ detector khúc xạ, huỳnh quang, điện hĩa.

f/ Thiết bị hiển thị kết quả

Cĩ nhiều loại nhưng đơn giản và phổ biến nhất là máy tự ghi để tín

hiệu đo dưới dạng pic.

Sơ đồ khối hệ thống HPLC được tổng quát ở hình 2

Hình 2: Sơ đồ khối tổng quát hệ thống HPLC

1.3.5. Cách đánh giá pic,,,

1.4.2.1. Phương pháp đo phổ trực tiếp:

Đo độ hấp thụ của dung dịch, tính nồng độ C của dung dịch dựa vào giá

trị 11%

cmE biết trước (tra cứu).

A = 11%

cmE .C.l → C = 1

1%

cm

A

E

(với l =1 cm)

17

Trong phương pháp này, phải chú ý kiểm tra máy đo về bước sĩng (ở) và

mật độ quang A bằng cách:

 Dùng đèn thuỷ ngân, đèn D2 (cho một vạch sáng cĩ bước sĩng xác

định).

 Dùng một mẫu chuẩn, đo và điều chỉnh để tìm sai số.

 Dùng một kính lọc Holmium (cĩ các giá trị ởmax xác định cho trong

tài liệu )để kiểm tra lại máy.

 Dùng dung dịch K2CrO4, K2Cr2O7 tinh khiết quang phổ pha thành

dung dịch cĩ nồng độ chính xác. Đo phổ tìm các giá trị ởmax và tìm

Amax .

1.4.2.2. Phương

pháp so sánh

Đo độ hấp thụ Ax, Ac của dung dịch thử cĩ nồng độ Cx (chưa biết) và của

dung dịch chuẩn cĩ nồng độ Ac (đã biết).

Ta cĩ: x

c

A

A

=

xC

cC

→ Cx = x

c

A

A

x Cc

Chú ý: nồng độ của dung dịch thử Cx và của dung dịch chuẩn Cc khơng

được chênh lệch nhau quá nhiều. Nồng độ dung dịch này càng gần nhau, kết

quả càng chính xác.

Ngồi ra cịn cĩ các kỹ thuật định lượng khác như: phương pháp đường

chuẩn, phương pháp thêm đường chuẩn, phương pháp chuẩn độ đo quang,

phương pháp định lượng hỗn hợp theo nguyên tắc cộng phổ .

18

PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu

2.1.1. Nguyên liệu, hố chất, thuốc thử:

2.1.1.1. Đối tượng nghiên cứu:

. Berberin clorid: Chất chuẩn hàm lượng 83,3% do Viện kiểm nghiệm

thuốc TW cung cấp

. Berberin clorid dạng nguyên liệu do bộ mơn Hố Dược cung cấp

. Palmatin: do viện kiểm nghiệm thuốc TW cung cấp

2.1.1.2. Hố chất, thuốc thử:

. Muối potasium dihydrophosphate (KH2PO4), acid phosphoric

(H3PO4)

. Heptane sodium sulfonate, triethylamine

. Acetonitril dùng cho HPLC (Merk)

. Nước cất 2 lần (cất trực tiếp tại Bộ mơn Hĩa vơ cơ trường đại học

Dược Hà Nội) dùng cho máy HPLC

. Một vài hĩa chất khác

2.1.1.3. Thiết bị:

+ Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao: DIONEX- Detector UV Diode

array- PDA 100

+ Cân phân tích AY 220 , Max = 220 g, độ chính xác 0,1 mg

+ Máy đo pH JENWAY của Anh

+ Máy cất nước 2 lần

+ Máy lắc siêu âm EBRO ARMATUREN của Đức

19

+ Máy lọc hút chân khơng Satorius

+ Bình định mức các loại: 20,0 ml; 25,0 ml; 100,0 ml …

+ Cốc cĩ mỏ: các loại 100; 200; 500

+ Pipet chính xác, pipet thường, đũa thủy tinh.

+ Bơm tiêm, lọ đựng mẫu, màng lọc 0,45 µm…

2.1.2. Phương pháp nghiên cứu:

2.1.2.1. Chỉ tiêu nghiên cứu:

. Phân tích mẫu thử bằng phương pháp HPLC và phương pháp đo

quang phổ hấp thụ UV- VIS

. Đánh giá độ chính xác, tính đúng, tính tuyến tính, tính đặc hiệu của

hai phương pháp trên

. So sánh 2 phương pháp trên

2.1.2.2. Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu:

 Nghiên cứu trên lý thuyết và tài liệu tham khảo để lựa chọn

phương pháp phân tích

 Bằng thực nghiệm, dựa vào kết quả thu được, xử lý thống kê và

rút ra kết luận

 Phương pháp sử dụng trong thực nghiệm: HPLC, Đo quang phổ

hấp thụ UV-VIS

2.1.2.3.Phương pháp xử lý số liệu thống kê:

. Dữ liệu thu được được xử lý bằng phương pháp thống kê – sử dụng

cơng cụ hỗ trợ là phần mềm Microsoft Excel

. Một số đặc trưng thống kê được sử dụng:

– Giá trị trung bình: ∑

=

=

n

1i

ixn

1

x

– Độ lệch chuẩn:

( )

1n

x

S

n

1i

2

ix

−

−

=

∑

=

20

– Độ lệch chuẩn tương đối (RSD): RSD% = S

x

× 100

– Sai số chuẩn :

n

S

sx =

– Sai số tương đối: ( ) 100

x

% st x)1n( ××=ε −α

– Khoảng tin cậy: µ = x ± tαSx

Trong đĩ : xi là kết quả xác định lần thứ i ; n là số lần xác định

+ Tiêu chuẩn Fischer để đánh giá độ chính xác hay độ lặp lại của 2

phương pháp thí nghiệm khác nhau : Ftn =

2

1

2

2

S

S

nghĩa thống kê

nhau cĩ ý nghĩa thống kê

 Ftn

nhau khơng cĩ ý nghĩa thống kê

 Flt tra bảng ở mức tin cậy 95% khi bậc tự do K = n – 1

+ Test T để so sánh giá trị trung bình kết quả định lượng của hai

phương pháp khác nhau :

T =

1 2

1 2

1 1p

n n

X X

S +

−

( ) ( )2 21 1 2 2

1 2

1 1

2

n S n S

n n

− + −

+ −

21

 T < 1 2 2/2n ntα

+ −

: giá trị trung bình kết quả định lượng của hai

phương pháp khác nhau khơng cĩ ý nghĩa thống kê

+ −

: giá trị trung bình kết quả định lượng của hai

phương pháp khác nhau cĩ ý nghĩa thống kê

 1 2 2/2

n ntα

+ −

tra bảng ở mức tin cậy 95% khi bậc tự do K = n1+n2-2

2.2. Kết quả thực nghiệm :

2.2.1. Định lượng Berberin clorid nguyên liệu bằng phương pháp đo

quang phổ hấp thụ UV-VIS theo DĐVN III *

Cách tiến hành :

+ Dung dịch thử : Cân 0,200 g chế phẩm và hồ tan trong 200 ml

nước bằng cách đun nĩng. Sau đĩ làm lạnh và thêm nước đến 1000 ml. Lấy

10 ml dung dịch này pha lỗng với nước đến 100 ml (C = 20 µ g/ml)

+ Dung dịch chuẩn được pha tương tự dung dịch thử , dùng chất đối

chiếu berberin clorid

+ Đo độ hấp thụ của dung dịch thử và dung dịch chuẩn trong cùng

điều kiện tại bước sĩng cực đại 421 nm với mẫu trắng là nước cất, cốc đo dày

1 cm.

* Cách tính kết quả :

*

Do cĩ sẵn berberin, mặt khác dự định áp dụng phương pháp này cho cả berberin trong các dạng bào chế nên

chúng tơi thay kali dicromat bằng berberin chuẩn.

22

Theo phương pháp so sánh, hàm lượng phần trăm được tính theo cơng

thức : C% = t c

c t

mA

mA

×

×

× C

Trong đĩ :

C% : Hàm lượng % Berberin clorid cĩ trong mẫu thử.

C : Hàm lượng % Berberin clorid cĩ trong mẫu chuẩn

At : Độ hấp thụ của dung dịch thử.

Ac : Độ hấp thụ của dung dịch chuẩn.

mt : Khối lượng tính bằng gam của Berberin clorid trong bột

nguyên liệu đã cân để pha dung dịch thử.

mc : Khối lượng tính bằng gam của Berberin clorid chuẩn đã

cân để pha dung dịch chuẩn.

Tiến hành định lượng 5 mẫu. Kết quả ghi trong bảng 1 .

Bảng1 : Kết quả định lượng Beberin clorid trong nguyên liệu

STT Khối lượng cân(g) Độ hấp thụ(A) C%

1 0,1971 0,269 86,50

2 0,2010 0,272 85,76

3 0,2062 0,280 86,06

4 0,2090 0,285 86,42

5 0,2030 0,277 86,48

Chuẩn 0,2001 0,263 83,30

23

Theo kết quả ở bảng 1, ta cĩ:

 Giá trị trung bình: X = 86,24%

 Độ lệch chuẩn : S = 0,324

 Khoảng tin cậy của giá trị trung bình (ở mức tin cậy 95%):

∆X(%) = 0,40

 Độ lệch chuẩn tương đối: RSD = 0,37%

Kết luận: Hàm lượng Beberin clorid trong bột nguyên liệu là 86,24%

± 0,40%.

2.2.2. Đánh giá phương pháp định lượng Berberin clorid nguyên liệu

bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo DĐVN III

2.2.2.1./Tính chính xác :

Nguyên tắc: Độ chính xác của phương pháp được đánh giá bằng độ

lệch chuẩn tương đối của các phép thử song song.

Cách tiến hành và kết quả được trình bày như trong phần 2.2.1.1

Kết quả thử độ chính xác của phương pháp cho thấy độ lệch chuẩn

tương đối của các kết quả (RSD = 0,37% < 2%). Như vậy phương pháp là

chính xác

2.2.2.2 Tính tuyến tính:

Tiến hành khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp

thụ trên chất chuẩn Berberin.

Cân 5 mẫu chất chuẩn Berberin clorid cĩ khối lượng từ 0,1600g→

0,2400g ( tại các điểm 80%,90%,100%,110%,120% nồng độ dùng khi định

lượng)

Cách tiến hành tương tự 2.2.1

Bảng 2: Sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ dung dịch

24

STT 1 2 3 4 5

C

(mg/ml)

0,0161 0,0180 0,0202 0,0220 0,0240

A 0,215 0,239 0,262 0,286 0,315

Hình 6 .Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào

nồng độ dung dịch

– Phương trình hồi quy biểu thị mối tương quan giữa mật độ quang và

nồng độ dung dịch là: y = 12,5 x + 0,013;

– Hệ số tương quan: 0,998

– Độ lệch chuẩn của y_ intercept: Sb = 0,009

– Với độ tin cậy 95% ta cĩ khoảng tin cậy của y_intercept:

b ±3,182Sb = 0,013 ± 0,029 hay – 0,016 ≤ y_intercept ≤ 0,042

Từ kết quả trên cho thấy hệ số tương quan của đường hồi quy vượt

quá 0,99…Tất cả các giá trị nằm trên đường hồi quy hoặc phân bố đồng đều

cả hai phía của đường hồi quy.

Khoảng tin cậy của y_intercept chứa 0.

Vậy phương pháp là tuyến tính trong khoảng nồng độ từ 80% đến

120% nồng độ làm việc.

y = 12.5x + 0.013

R = 0.998

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03

§

é

h

Êp

t

h

ơ

A

C(mg/ml)

25

2.2.2.3. Độ đúng:

. Cân 3 mẫu chất đối chiếu Beberin clorid ( hàm lượng 83,3%) với

khối lượng từ 0,1600g → 0,2400g (tại các điểm 80, 100, 120% so với lượng

cân dùng khi định lượng)

. Tiến hành tương tự 2.2.1. Mỗi mẫu đo 3 lần, lấy kết quả trung bình

. Tính tốn kết quả khảo sát độ đúng dựa vào độ hấp thụ của mẫu

chuẩn là 0,263 ứng với khối lượng cân 0,2001g

Kết quả thu được ghi ở bảng 3

Bảng 3: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đo quang phổ

hấp thụ UV-VIS

STT Khối

lượng cân

(g)

Lượng hoạt

chất cĩ thực

a (g)

Độ hấp

thụ trung

bình (A)

Lượng tìm

lại trung

bình b (g)

Phần trăm

tìm lại

(b/a.100%)

1 0,1605 0,1337 0,208 0,1322 98,88

2 0,2020 0,1683 0,267 0,1696 100,77

3 0,2362 0,1967 0,313 0,1984 100,86

Từ kết quả bảng 3 ta cĩ:

– Trung bình % tìm lại: 100,17%

– Phương trình hồi quy về mối tương quan giữa lượng hoạt chất ban

đầu và lượng hoạt chất tìm lại là: y = 1,052x – 0,008

– Hệ số tương quan: r = 0,999

26

– Độ lệch chuẩn của y_intercept: Sb = 0,003

– Độ lệch chuẩn của độ dốc: Sa = 0,019

– Với độ tin cậy 95% ta cĩ:

Khoảng tin cậy của độ dốc: a ± 3,182Sa = 1,052 ± 0,060 hay 0,992

< a < 1,112

Khoảng tin cậy của y_intercept: b ± 3,182Sb = – 0,008 ± 0,009

hay – 0,017 < y_intercept < 0,001

Hình 7: Đồ thị biểu diễn phương trình hồi quy tuyến tính về mối

tương quan giữa lượng hoạt chất tìm lại và lượng hoạt chất cĩ thực

Kết luận:

– Khơng cĩ sai số hệ thống hằng định vì khoảng tin cậy của

y_intercept chứa 0.

– Khơng cĩ sai số hệ thống tỷ lệ vì khoảng tin cậy độ dốc chứa 1.

– Giá trị trung bình của tỷ lệ thu lại là 100,17% nghĩa là nằm trong

khoảng từ 98% đến 102%.

Như vậy, phương pháp đưa ra là đúng trong khoảng khảo sát.

2.2.2.4. Tính đặc hiệu:

Như trong phần 1.1.2 đã trình bày, các tạp chất cần xác định trong

Berberin nguyên liệu là Palmatin và Jatrorrhizin. Nhưng trong điều kiện thí

nghiệm khơng cĩ chất chuẩn Jatrorrhizin, chúng tơi chỉ tiến hành xác định sự

ảnh hưởng của tạp chất Palmatin đối với phương pháp định lượng

y = 1.052x – 0.008

R = 0.999

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25

L

ỵ

n

g

t

×m

l

¹i

(

g

)

Lỵng ho¹t chÊt cã thùc (g)

27

Tiến hành:

+ Cân 0,200 g chất chuẩn berberin clorid và hịa tan trong 200 ml

nước bằng cách đun nĩng. Sau đĩ làm lạnh và thêm nước đến 1000 ml, thu

được dunhg dịch berberin chuẩn 0,2 mg/ml. Lấy 10 ml dung dịch này cho vào

4 bình định mức 100 ml.

+ Pha dung dịch Palmatin 10%, 5% và 2,5% so với nồng độ của

berberin clorid đem đo

. Cân 0,02 g Palmatin chuẩn và hịa tan trong 20 ml nước bằng cách

đun nĩng. Sau đĩ làm lạnh và thêm nước đến 100 ml. Lấy 10 ml dung dịch

này cho vào bình định mức 100 ml và thêm nước vừa đủ tới vạch, được dung

dịch palmatin chuẩn 0,02 mg/ml

. Lấy 25 ml dung dịch palmatin 0,02 mg/ml cho vào bình định mức 50

ml và thêm nước vừa đủ tới vạch, ta được dung dịch palmatin 0,01 mg/ml.

. Lấy 25 ml dung dịch palmatin 0,01 mg/ml cho vào bình định mức

50 ml và thêm nước vừa đủ tới vạch, được dugn dịch palmatin 0,005 mg/ml.

. Lần lượt thêm 10 ml dung dịch palmatin 0,02; 0,01; 0,005 mg/ml

vào 3 bình định mức 100 ml đã chứa berberin clorid chuẩn trên và thêm nước

vừa đủ tới vạch. Một bình định mức 100 ml khơng thêm palmatin và thêm

nước tới vạch. Đem đo độ hấp thụ quang của dung dịch 4 bình này tại bước

sĩng 421 nm

Bảng 4: Kết quả thu được về sự ảnh hưởng của tạp chất palmatin tới

độ hấp thụ quang của berberin clorid

Bình 1 Bình 2 Bình 3 Bình 4

Berberin clorid 0,2 mg/ml

(ml)

10 10 10 10

Palmatin 0,02 mg/ml (ml) 10

Palmatin 0,01 mg/ml (ml) 10

28

Palmatin 0,005 mg/ml (ml) 10

Độ hấp thụ A 0,263 0,282 0,271 0.266

Nhận xét: Từ kết quả bảng trên, ta thấy độ hấp thụ quang của dung

dịch tăng theo sự tăng của nồng độ dung dịch palmatin. Khi thêm 2,5%

palmatin, hàm lượng berberin trong bột nguyên liệu định lượng theo phương

pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS của DĐVN III tăng 1,14%. Nếu cĩ 2%

palmatin như trong giới hạn về palmatin mà DĐVN III yêu cầu thì kết quả

định lượng tăng 0,91%

Vậy phương pháp khơng cĩ tính đặc hiệu.

2.2.3. Định lượng berberin clorid nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển

Trung Quốc (2005):

Điều kiện sắc ký để định lượng Berberin clorid nguyên liệu

– Cột sắc ký: hạt nhồi silicagel được octadecylsilan hĩa

– Detector UV: 263 nm

– Pha động: đệm phosphate BERBERIN T H10,4 UV_VIS_1

mAU

min

1 – 4.653

2 – 7.420

WVL:263 nmAz

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.1

-0.10

1.0 ] UV_VIS_1

mAU

min

WVL:263 nm

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.1

-5.0

35.0 BERBERIN CH UV_VIS_1

mAU

min

1 – 7.353

WVL:263 nm

36

Các tính tốn được thực hiện trên các kết quả thu được khi định lượng

Berberin clorid nguyên liệu do bộ mơn Hĩa Dược trường Đại Học Dược Hà

Nội cung cấp.

Tĩm tắt kết quả thu được khi định lượng nguyên liệu Berberin clorid

bằng hai phương pháp ở bảng 9

Bảng 9: Tĩm tắt các kết quả thực nghiệm thu được khi định lượng

nguyên liệu Berberin clorid

Phương

pháp

Hàm lượng

trung bình

(%)

Phương sai

(S2)

Độ lêch

chuẩn (S)

Số lần thí

nghiệm

HPLC 86,09 0,0645 0,254 5

Đo quang

UV-VIS

86,24 0,1050 0,324 5

Ftn = 0,1050/0,0645 = 1,3

S1: độ lệch chuẩn của phương pháp đo quang UV-VIS

S2: độ lệch chuẩn của phương pháp HPLC

Flt ( ở mức tin cậy 95% khi bậc tự do K1 = 5 – 1 = 4; K2 = 5 – 1 = 4) là:

6,39

Như vậy Ftn

Berberin nguyên liệu khác nhau khơng cĩ ý nghĩa thống kê.

2.2.3.2. So sánh kết quả giá trị trung bình của hai phương pháp định

lượng

:

Do độ lặp lại của 2 phương pháp định lượng khác nhau khơng cĩ ý

nghĩa thống kê nên để so sánh kết quả giá trị trung bình của hai phương pháp

định lượng, ta dùng Test T.

37

T =

1 2

1 2

1 1p

n n

X X

S +

−

với

pS =

( ) ( )2 21 1 2 2

1 2

1 1

2

n S n S

n n

− + −

+ −

T phân phối Student với n1 + n2 – 2 bậc tự do

ở mức tin cậy 95% hay ỏ =0,05, ta cĩ: ( )1 2 2 8/2 0,025n nt tα

+ −

= =2,306

pS =

4.0,0645 4.0,1050

5 5 2

+

+ −

= 0,291

Do đĩ Tqs =

86,24 86,09

1 10,291

5 5

−

+

= 0,815

Như vậy 0,815 < 2,306 nên với mức ý nghĩa 0,05 giá trị trung bình

hàm lượng Berberin trong nguyên liệu của hai phương pháp định lượng khác

nhau khơng cĩ ý nghĩa thống kê.

2.2.3.2. Đánh giá ưu nhược điểm của hai phương pháp định lượng

Berberin clorid trong bột nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung

Quốc (2005) và bằng đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo DĐVN III

 Phương pháp HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005):

+ Ưu điểm:

. Phương pháp cĩ tính đặc hiệu khi cĩ mặt tạp chất palmatin

+ Nhược điểm:

. Yêu cầu phải cĩ các hĩa chất dung mơi tinh khiết dùng cho HPLC

. Chi phí cao khi phải chạy pha động cĩ acetonitril và đặc biệt là hĩa

chất heptan natri sulfonat rất đắt tiền

. Quá trình chuẩn bị chạy sắc ký và chạy đường nền tốn thời gian

 Phương pháp đo quang phổ UV-VIS theo DĐVN III:

+ Ưu điểm:

. Khơng tốn hĩa chất dung mơi

38

. Thời gian phân tích nhanh chĩng, chỉ cần 5-10 phút cĩ thể cho biết

ngay kết quả

. Kỹ thuật thao tác đơn giản, máy mĩc dễ tìm, gọn nhẹ

+ Nhược điểm:

Phương pháp khơng cĩ tính đặc hiệu (palmatin ảnh hưởng tới kết quả

định lượng)

2.3. BÀN LUẬN:

Phương pháp HPLC là một phương pháp phân tích hiện đại, đang

từng bước được đưa vào phịng kiểm nghiệm và trung tâm kiểm nghiệm ở

Việt Nam. Phương pháp định lượng Berberin nguyên liệu bằng HPLC theo

dược điển Trung Quốc (2005) cho biết hàm lượng Berberin trong nguyên liệu

là 86,09% ± 0,315%; phương pháp chính xác với RSD = 0,295% < 2%, tuyến

tính trong khoảng 80%-120% nồng độ định lượng và đúng trong khoảng khảo

sát. Ưu điểm của phương pháp này là cĩ tính đặc hiệu khi cĩ mặt tạp chất

palmatin trong nguyên liệu Berberin. Tuy nhiên phương pháp này lại rất tốn

kém khi phải dùng những dung mơi và hĩa chất đắt tiền như: natri heptan

sulfonat, acetonitril…

Hàm lượng Berberin trong nguyên liệu khi định lượng bằng phương

pháp đo quang phổ UV-VIS theo DĐVN III là 86,24% ± 0,40%; phương

pháp chính xác với RSD = 0,37% < 2%, tuyến tính trong khoảng 80%-120%

nồng độ định lượng và đúng trong khoảng khảo sát nhưng khơng đặc hiệu (

tạp chất palmatin ảnh hưởng tới kết quả định lượng). Tuy nhiên. DĐVN III cĩ

quy định giới hạn tạp chất palmatin khơng quá 2% ………………………………………………………………… 5

1.1.7. Dạng thuốc và hàm lượng: , ……………………………………………………………….. 6

1.2.4. Phương pháp HPLC ………………………………………………………………… 7

1.3. TỔNG QUAN PHƯƠNG PHÁP HPLC ……………………………………….. 9

1.3.1. Nguyên tắc ………………………………………………………………………………. 9

1.3.2. Cơ sở lý thuyết ………………………………………………………………………… 9

1.3.3. Các thơng số đặc trưng của quá trình sắc ký: …………………………… 10

Hình 1: sắc ký đồ của 2 chất và các thơng số đặc trưng ………………………. 10

1.3.2.1. Hệ số dung lượng k’ ………………………………………………………………. 10

1.3.2.2 Độ chọn lọc α (selectivity – factor) …………………………………………… 11

α khác 1 càng nhiều thì khả năng tách càng rõ ràng, tối ưu từ 1,5 đến 2. …… 11

1.3.2.3. Độ phân giải (resolution) ………………………………………………………. 11

=R

( ) ( )





























α

−α

=

+

−

=

+

−

+ ‘k1

‘k

ww

tt

ww

tt

B

B

A2/1B2/1

A,RB,R

AB

A,RB,R 1

4

N18,12

…………………. 11

Độ phân giải cơ bản đạt được khi R = 1,5 ……………………………………………. 11

1.3.2.4. Hệ số bất đối AF …………………………………………………………………… 11

Cho biết mức độ cân đối của pic sắc ký, nĩ được tính theo cơng thức: ……… 11

Trong đĩ:………………………………………………………………………………………… 11

1.3.2.5. Số đĩa lý thuyết N ………………………………………………………………….. 11

N = 16 











w

t

B

R

2

hay N=5,54 











w

t

B2/1

R

2

……………………………… 12

1.3.4. Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC ………………………………. 12

a/Hệ thống bơm ………………………………………………………………………………. 12

a/ Bình chứa dung mơi và hệ thống xử lý dung mơi …………………………….. 12

c/ Hệ tiêm mẫu ……………………………………………………………………………….. 12

44

d/ Cột sắc ký lỏng HPLC ………………………………………………………………….. 12

e/ Detector trong HPLC ……………………………………………………………………. 13

Hình 2: Sơ đồ khối tổng quát hệ thống HPLC ……………………………………. 13

1.3.5. Cách đánh giá pic,,, …………………………………………………………………………………. 16

1.4.2.1. Phương pháp đo phổ trực tiếp: ………………………………………………. 16

1.4.2.2. Phương

pháp so sánh …………………………………………………………… 17

PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ ………………………………………. 18

2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu ……………………………… 18

2.1.1. Nguyên liệu, hố chất, thuốc thử: ……………………………………………. 18

2.1.1.1. Đối tượng nghiên cứu: …………………………………………………………. 18

2.1.1.2. Hố chất, thuốc thử: ……………………………………………………………. 18

2.1.1.3. Thiết bị: ……………………………………………………………………………… 18

2.1.2. Phương pháp nghiên cứu: ………………………………………………………. 19

2.1.2.1. Chỉ tiêu nghiên cứu: ……………………………………………………………. 19

2.1.2.2. Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu: ……………………… 19

2.1.2.3.Phương pháp xử lý số liệu thống kê: ……………………………………… 19

2.2. Kết quả thực nghiệm : ………………………………………………………………. 21

2.2.1. Định lượng Berberin clorid nguyên liệu bằng phương pháp đo

quang phổ hấp thụ UV-VIS theo DĐVN III ……………………………………. 21

Bảng1 : Kết quả định lượng Beberin clorid trong nguyên liệu……………. 22

2.2.2. Đánh giá phương pháp định lượng Berberin clorid nguyên liệu

bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo DĐVN III ……. 23

2.2.2.1./Tính chính xác : ………………………………………………………………….. 23

Nguyên tắc: Độ chính xác của phương pháp được đánh giá bằng độ lệch

chuẩn tương đối của các phép thử song song. ……………………………………….. 23

2.2.2.2 Tính tuyến tính: ……………………………………………………………………. 23

Bảng 2: Sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ dung dịch ………… 23

Hình 6 .Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào ………………. 24

2.2.2.3. Độ đúng: …………………………………………………………………………….. 25

2.2.2.4. Tính đặc hiệu:……………………………………………………………………… 26

Bảng 4: Kết quả thu được về sự ảnh hưởng của tạp chất palmatin tới … 27

45

2.2.3. Định lượng berberin clorid nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển

Trung Quốc (2005): ………………………………………………………………………… 28

HL% = 83,30t c

c t

S m

S m

× ×

×

………………………………………………………………………. 29

Bảng 5: Kết quả định lượng Berberin clorid nguyên liệu …………………… 29

2.2.4. Đánh giá phương pháp định lượng berberin clorid nguyên liệu

bằng HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005): ………………………………. 30

2.2.4.1. Tính chính xác: …………………………………………………………………… 30

2.2.4.2. Tính tuyến tính: …………………………………………………………………… 30

Bảng 6: Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ dung dịch ………….. 30

2.2.4.3. Tính đúng: ………………………………………………………………………….. 31

Bảng 7: Kết quả khảo sát tính đúng của phương pháp HPLC ……………. 32

2.2.4.4. Tính đặc hiệu:……………………………………………………………………… 33

Hình 12: Sắc ký đồ mẫu trắng ………………………………………………………….. 35

Hình 13: Sắc ký đồ mẫu chuẩn …………………………………………………………. 35

Hình 14: Sắc ký đồ mẫu chuẩn cĩ thêm Palmatin ……………………………….. 35

2.2.5. So sánh hai phương pháp định lượng Berberin clorid trong bột

nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung Quốc 2005 và đo quang

phổ hấp thụ UV-VIS theo dược điển Việt Nam III: …………………………… 35

2.2.5.1. So sánh kết quả độ chính xác của hai phương pháp định lượng: 35

2.2.3.2. So sánh kết quả giá trị trung bình của hai phương pháp định

lượng

: …………………………………………………………………………………………… 36

2.2.3.2. Đánh giá ưu nhược điểm của hai phương pháp định lượng

Berberin clorid trong bột nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung

Quốc (2005) và bằng đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo DĐVN III ….. 37

. Khơng tốn hĩa chất dung mơi …………………………………………………………… 37

. Kỹ thuật thao tác đơn giản, máy mĩc dễ tìm, gọn nhẹ ………………………….. 38

2.3. BÀN LUẬN: …………………………………………………………………………….. 38

KẾT LUẬN ……………………………………………………………………………………. 39

* Kết luận ………………………………………………………………………………………. 39

* Đề xuất: ………………………………………………………………………………………. 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO ………………………………………………………………. 41

I. Tiếng việt ……………………………………………………………………………………. 41

II. Tiếng Anh …………………………………………………………………………………. 41

III. Trang web ……………………………………………………………………………….. 42

Các file đính kèm theo tài liệu này:

--- Bài cũ hơn ---

--- Bài mới hơn ---

Học phần này quan tâm đến việc sử dụng các phương pháp định lượng để hỗ trợ ra quyết định. Sự nhấn mạnh không chỉ ở chính phương pháp mà hơn thế là các phương pháp được sử dụng như thế nào để đóng góp tốt hơn trong việc ra quyết định. Chúng ta quan tâm đến việc mô tả những tình huống mà phương pháp định lượng được sử dụng thành công và trình bày việc nhà quản trị dùng các phương pháp để ra quyết định tốt hơn. Cách tiếp cận định lượng để ra quyết định có nhiều tên gọi khác nhau. Tên gọi được sử dụng phổ biến là Phương pháp định lượng trong kinh tế (Quantitative Methods for Business), Khoa học quản trị (Management science), Vận trù học (Operations research), và Khoa học quyết định (Decision science). Tất cả đều quan tâm đến cách tiếp cận lý trí để ra quyết định dựa trên cơ sở những phương pháp khoa học.

Cuộc cách mạng quản trị có tính khoa học của đầu năm 1900 được khởi xướng bởi Frederic W. Taylor đã cung cấp những cơ sở cho việc dùng phương pháp định lượng trong quản trị. Nhưng những nghiên cứu khoa học quản trị hiện đại bắt đầu trong thời kỳ chiến tranh thế giới thứ 2. Sau chiến tranh, rất nhiều người tiếp tục nghiên cứu cách tiếp cận định lượng để ra quyết định. Có hai thành tựu ảnh hưởng đến dẫn đến sự tăng cường và sử dùng phương pháp định lượng trong nhiều ứng dụng phi quân sự. Đầu tiên, đó là thành tựu trong phương pháp luận định lượng mà cụ thể thành tựu có ý nghĩa rất lớn là phương pháp đơn hình để giải các bài toán qui hoạch tuyến tính của George Dantzig, năm 1947. Nhờ nó mà nhiều phương pháp luận định lượng đã phát triển và năm 1957 cuốn sách đầu tiên về vận trù học của Churchman, Ackoff và Arnoff đã xuất bản. Thành tựu thứ hai có ảnh hưởng đến phát triển phương pháp luận định lượng là sự bùng nổ của máy tính. Máy tính có thể giúp cho những người thực hành có thể giải các bài toán lớn khác nhau. Do vậy, phương pháp định lượng ngày càng được sử dụng rộng rãi trong phân tích kinh tế.

Giáo trình học phần Phương pháp định lượng trong kinh tế của nhóm tác giả Lê Dân (chủ biên) và Nguyễn Trung Kiên:

Chương 1: Tổng quan về phương pháp định lượng

Chương 2: Qui hoạch tuyến tính

Chương 3: Mô hình mạng

Chương 4: Điều hành dự án bằng PERT/CPM

Chương 5: Mô hình hàng chờ

Chương 6: Phân tích Markov

Số lượt thích

Đang tải…

--- Bài cũ hơn ---

--- Bài mới hơn ---

Phương Nguyễn, ĐH Kinh Tế tp.HCM (7/2011)

NGUỒN: http://sotaynghiencuusinhvien.blogspot.com

Khi phối hợp giữa hai phương pháp, nghiên cứu định tính cung cấp thông tin chỉ trên những trường hợp nghiên cứu cụ thể, và bất kỳ những kết luận tổng quát nào rút ra chỉ là các giả thuyết và nghiên cứu định lượng có thể được sử dụng để kiểm tra lại, những giả thuyết kia cái nào là đúng.

1. Phương pháp nghiên cứu định lượng:

Phương pháp định lượng là phương pháp sử dụng những kỹ thuật nghiên cứu để thu thập dữ liệu định lượng – thông tin có thể biểu hiện bằng các con số và bất cứ gì có thể đo lường được. Thống kê, bảng biểu và sơ đồ, thường được sử dụng để trình bày kết quả của phương pháp này.

Trong khoa học xã hội, nghiên cứu định lượng chỉ sự điều tra nghiên cứu theo lối kinh nghiệm có phương pháp của các đặc tính số lượng và các hiện tượng, mối quan hệ giữa chúng. Mục tiêu của nghiên cứu định lượng là phát triển và sử dụng các mô hình toán học, lý thuyết và/hoặc các giả thuyết gắn liền với hiện tượng. Cách thức tiến hành đo lường là trung tâm của nghiên cứu định lượng bởi vì nó cung cấp sự liên kết quan trọng giữa quan sát theo lối kinh nghiệm và biểu thức toán học của các mối quan hệ theo định lượng.

Những mối quan hệ và những tập hợp theo lối kinh nghiệm cũng thường được nghiên cứu bằng cách sử dụng một số loại hình thức của mô hình tuyến tính tổng quát, mô hình phi tuyến, hoặc sử dụng phân tích nhân tố. Một nguyên tắc nền tảng trong nghiên cứu định lượng là sự tương quan không ám chỉ đến nguyên nhân. Vì luôn có khả năng một mối quan hệ giả tạo tồn tại đối với các biến khi hiệp phương sai được tìm thấy ở mức độ nào đó.

1. Phương pháp nghiên cứu định tính:

Nghiên cứu định tính là phương pháp sử dụng các câu hỏi, hướng mục đích vào tập hợp sự hiểu biết sâu về hành vi con người và lý do chi phối hành vi đó. Phương pháp định tính thường hướng vào câu hỏi tại sao đưa ra quyết định và đưa ra bằng cách nào, chứ không chỉ là cái gì, khi nào và ở đâu. Do đó, mẫu nhỏ nhưng tập trung thì thường cần thiết hơn là mẫu lớn.

Phương pháp định tính mang lại thông tin tập trung vào những trường hợp nghiên cứu cụ thể, và bất kỳ kết luận chung nào thì cũng là những thành phần chứ không phải toàn bộ. Phương pháp định tính có thể sử dụng để tìm kiếm sự hỗ trợ từ phía kinh nghiệm cho giả thuyết nghiên cứu.

Cách tiếp cận định tính có lợi thế là cho phép sự đa dạng hơn trong trả lời cũng như khả năng đáp ứng với những phát triển hoặc vấn đề mới trong quá trình nghiên cứu. Nghiên cứu định tính có thể tốn kém chi phí và thời gian, nhiều lĩnh vực nghiên cứu sử dụng kỹ thuật định tính được phát triển riêng biệt nhằm cung cấp kết quả cô đọng, hiệu quả về chi phí và thời gian hơn.

Trước tiên, trong nghiên cứu định tính, các trường hợp được lựa chọn có mục đích – chúng có điển hình cho các tính chất nào đó hoặc vị trí cụ thể nào đó hay không.

Thứ hai, vai trò của nhà nghiên cứu định tính nhận nhiều chú ý, phê bình hơn. Đó là do vấn đề đạo đức, nhà nghiên cứu trong nghiên cứu định tính phải giữ vai trò trung lập. Do đó họ cần nêu rõ vai trò của mình trong quá trình nghiên cứu và trong phân tích.

Thứ ba, trong khi phân tích dữ liệu định tính có thể bằng rất nhiều dạng, khác với nghiên cứu định lượng ở chỗ nó tập trung vào ngôn ngữ, dấu hiệu và ý nghĩa. Thêm vào đó, cách tiếp cận nghiên cứu định tính theo cách nhìn toàn cảnh và theo ngữ cảnh, hơn là thu nhỏ và tách biệt. Nhiều phương pháp định tính yêu cầu nhà nghiên cứu mã hóa dữ liệu cẩn thận, phân biệt và lưu trữ hồ sơ một cách nhất quán và đáng tin cậy.

Thứ tư, nghiên cứu định tính cung cấp thông tin chỉ trên những trường hợp nghiên cứu cụ thể, và bất kỳ những kết luận tổng quát nào rút ra chỉ là các giả thuyết. Nghiên cứu định lượng có thể được sử dụng để kiểm tra lại, những giả thuyết kia cái nào là đúng.

Phương pháp nghiên cứu định tính xen lẫn định lượng được Đặng Phong sử dụng cho tác phẩm “Tư duy Kinh tế Việt Nam 1975 – 1989”.

Ví dụ 1: Để chứng minh nhận định “Ngay từ năm 1977, đặc biệt là năm 1978, hàng loạt các sự kiện quốc tế, rồi thiên tai, địch họa… đã làm đảo lộn rất nhiều những dự kiến ban đầu của kế hoạch”, Đặng Phong đã sử dụng cách mô tả thực tế tình hình kinh tế những năm 1979-1980 với các sự kiện

 Chiến tranh biên giới Tây Nam

 Hai trận lũ lớn ở đồng bằng Nam Bộ

 Đầu vào từ các nước xã hôi chủ nghĩa giảm sút đột ngột

Và dùng số liệu khối lượng nhập khẩu 1976-1980 bằng hiện vật, GDP 1977-1980, tổng sản phẩm trong nước 1975-1985, tranh ảnh biếm họa, số liệu từ các ngành nông nghiệp, công nghiệp, thủy sản… để minh họa mức độ của các sự kiện đã ảnh hưởng đến kinh tế – xã hội thời kỳ đó như thế nào.

Thêm vào đó, phương pháp định tính thường hướng vào câu hỏi tại sao đưa ra quyết định và đưa ra bằng cách nào, chứ không chỉ là cái gì, khi nào và ở đâu, nghĩa là hiểu biết sâu về hành vi con người và lý do chi phối hành vi đó.

Ví dụ 2: Với nhận định “cả phong cách sống, làm việc và tư duy của Lê Duẩn đã in dấu ấn đậm nét lên đường lối kinh tế, chính sách kinh tế và thực tiễn kinh tế của Việt Nam trong suốt một phần tư thế kỷ”, Đặng Phong đã:

 Hỏi người trong gia đình về thuở thiếu thời, Lê Duẩn như thế nào.

 Trong những năm tù ở Côn Đảo, ông đã thể hiện như một nhà lãnh tụ về tư tưởng ra sao thông qua lời kể của các bạn tù (Trần Văn Giàu, Bùi Công Trừng).

 Thời kỳ kháng chiến, các quyết định nào của ông thể hiện phong cách tư duy độc lập, sáng tạo.

 ….

--- Bài cũ hơn ---

--- Bài mới hơn ---

Năm xuất bản:1983Số:5Trang:18-23+25

Nghiên cứu định lượng một số bazơ nitơ bậc bốn bằng phương pháp chiết cặp ion. Kết quả: bằng phương pháp kế hoạch hóa thí nghiệm đã khảo sát ảnh hưởng đồng thời của các yếu tố: pH dung dịch, nồng độ của tropeolin, dung môi lên quá trình chiết cặp ion của các bazơ nitơ bậc bốn: atropin sunfat, mocphin clohydrat, codein, novocain clohydrat, quinin sunfat và pilocacpin sunfat. Quá trình chiết tối ưu ở pH đệm axetat 4,5-5 với nồng độ của tropeolin 00 trong dung dịch trước khi chiết từ 0,03-0,041% bằng dung môi clorofoc hoặc hỗn hợp TCC:AA. Bằng thực nghiệm xác nhận chất bảo quản và các hệ đệm trong chế phẩm thuốc không ảnh hưởng đến kết quả định lượng.

Thuộc loại:

Tài Liệu Nội Khoa ” Tài liệu cơ sở

Loại tài liệu:

Portable Document Format (.pdf)

Gửi bởi:

Guest

Kích cỡ:

*******

Mức phí:

10.000 vnd

Lần tải:

*******

Mã tài liệu:

TLD34

Ngày gửi:

19-03-2014

THÔNG BÁO: từ tháng 04/2018 vì một số lý do bất khả kháng hệ thống nạp điểm bằng thẻ cào của chúng tôi sẽ buộc phải tạm dừng. Trong thời gian này quý khách nạp điểm vào hệ thống thực hiện bằng cách chuyển Khoản qua tài khoản Ngân hàng hoặc ví điện tử MOMO. HỖ TRỢ 0915.558.890

Thông tin tài khoản Ngân hàng của Chúng tôi:

Tên tài khoản: BÙI QUANG THỤ : Số tài khoản: 0451000273276

Ngân hàng TMCP Ngoại thương Việt Nam chi nhánh Thành Công-Hà Nội

Chuyển tiền qua ví điện tử MOMO

ví điện tử MOMO bạn có thể chuyển điểm qua số điện thoại 0915558890

Noitiethoc.com, chúng tôi chúng tôi hỗ trợ tìm tài liệu y học theo yêu cầu

+ Hỗ trợ tìm tải tài liệu y học các trang 123doc, xemtailieu, yhth, tailieu.vn…

+ Tìm sách báo, tiếng anh, tiếng pháp, giáo trình y học trong và ngoài nước..

Hotline : 0915.558.890 or 0978.770.836 EMail [email protected]

--- Bài cũ hơn ---

--- Bài mới hơn ---

Trường Đại Học Lạc HồngKhoa Công Nghệ Hóa- Thực Phẩm Đề Tài : Cách Xác Định Hàm Lượng Protein Và Acid Amin trong Thực Phẩm Bộ Môn : Hóa Phân Tích GVHD : TS. Phạm Trần Nguyên Nguyên Sinh Viên Đoàn Thị Tuyết Vân Lớp : 08TP113 Protein là thành phần không thể thiếu trong cơ thể sinh vật Là một trong 4 đại phân tử hình thành nên cấu tạo của tế bào Thực phẩm ngày nay rất đa dạng, việc xác định hàm lượng protein trong thực phẩm là thực sự cần thiết để đánh giá chất lượng sản phẩm của thực phẩm Từ đó người tiêu dùng dựa vào đó để quyết định khẩu phần thức ăn hàng ngày Lý Do Chọn Đề Tài Tổng Quan Về Protein. Tính chất của protein. Các phương pháp định tính acid amin. Các phương pháp định lượng acid amin. Các phương pháp định tính protein. Các phương pháp định lượng protein. Những yếu tố ảnh hưởng đến kết quả phân tích. Kết luận. Tài liệu tham khảo. MỤC LỤC I-Tổng quan về protein. 1.Cấu tạo phân tử protein. Đại phân tử sinh học Có mặt nhiều trong tế bào sống Tham gia vào nhiều phản ứng sinh hóa Thành phần của nhiều phức hợp Hình 1 : Cấu Tạo Phân Tử Protein 1- Cấu Tạo Phân Tử Protein Protein có cấu tạo từ 20 loại acid amin cơ bản Hình 2: Cấu Trúc Chung Của Acid Amin Acid amin (tên gọi và viết tắt) 1-Cấu Tạo Phân Tử Protein 1-Cấu Tạo Phân Tử Protein Acid amin (tên gọi và viết tắt) 1- Cấu Tạo Phân Tử Protein Cấu trúc không gian của acid amin Acid amin không phân cực với mạch bên là nhóm hydratcacbon 1- Cấu Tạo Phân Tử Protein Cấu trúc không gian của acid amin Acid amin phân cực với mạch bên tích điện dương 1- Cấu Tạo Phân Tử Protein Cấu trúc không gian của acid amin Acid amin phân cực với mạch bên tích điện âm Cấu trúc không gian của acid amin Acid amin với mạch bên không tích điện 1- Cấu Tạo Phân Tử Protein Cấu trúc không gian của acid amin Acid amin với mạch bên là vòng thơm 1- Cấu Tạo Phân Tử Protein Cấu trúc không gian của acid amin Acid amin đặc biệt 1- Cấu Tạo Phân Tử Protein Một Số Acid amin ít gặp trong tự nhiên 1- Cấu Tạo Phân Tử Protein Một Số Acid amin không có trong protein 1- Cấu Tạo Phân Tử Protein Vai Trò Của Acid Amin Rất quan trọng đối với cơ thể Cơ thể không thể tự tổng hợp được Phải cung cấp cho cơ thể bằng con đường thực phẩm Isoleucin, methionin, phenylalanin, valin, leucin, lysin, threonin cần cho cơ thể trưởng thành Arginin, histidin cần cho trẻ nhỏ 1- Cấu Tạo Phân Tử Protein 2.Cấu Trúc Protein Cấu Trúc Bậc 1 Các axit amin nối với nhau bởi liên kết peptit hình thành nên chuỗi polypepetide. Đầu mạch polypeptide là nhóm amin của axit amin thứ nhất và cuối mạch là nhóm cacboxyl của axit amin cuối cùng Hình 3 : Cấu trúc bậc 1 2.Cấu Trúc Protein Cấu Trúc Bậc 2 Là sự sắp xếp đều đặn các chuỗi polypeptide trong không gian. Chuỗi polypeptide thường không ở dạng thẳng mà xoắn lại tạo nên cấu trúc xoắn α và cấu trúc nếp gấp β Hình 4: Nếp gấp  Hình 5: Nếp gấp  2.Cấu Trúc Protein Cấu Trúc Bậc 3 Các xoắn α và phiến gấp nếp β có thể cuộn lại với nhau thành từng búi có hình dạng lập thể đặc trưng cho từng loại protein Hình 6: Cấu Trúc bậc 3 2.Cấu Trúc Protein Cấu Trúc Bậc 4 Khi protein có nhiều chuỗi polypeptide phối hợp với nhau thì tạo nên cấu trúc bậc bốn của protein Hình 7: Cấu Trúc bậc 4 chúng tôi trò sinh học của protein Cấu trúc Xúc tác Vận chuyển Vận động Bảo vệ Dẫn truyền xung thần kinh Điều hòa Kiến tạo, chống đỡ cơ học Dự trữ dinh dưỡng Quyết định chất lượng khẩu phần thức ăn Ảnh hưởng đến thành phần hóa học, cấu tạo xương Thiếu protein dẫn đến suy dinh dưỡng, chậm lớn, suy giảm miễn dịch, ảnh hưỡng xấu đến chức năng của các cơ quan 4.Giá trị dinh dưỡng của protein Tạo cấu trúc gel cho sản phẩm Giữ kết cấu, giữ khí, tạo độ xốp Tạo độ bền của bọt trong bia Tạo hình khối cho phomai Tạo màng bao chúng tôi trò của protein trong thực phẩm chúng tôi trò của protein trong thực phẩm Tương tác với đường tạo hương và màu cho sản phẩm Kết hợp với polyphenol tạo hương đặc trưng cho trà Cố định mùi, giữ hương II-Tính chất của protein 1.Hình dạng, khối lượng Hình sợi: keratin, miosin… Hình cầu: albumin, globulin… Tuy nhiên hai trạng thái này có thể chuyển đổi qua lại Xác định khối lượng protein bằng nhiều phương pháp: siêu ly tâm, đo áp suất thẩm thấu, đo tốc độ lắng…. II-Tính chất của protein 2.Tính lưỡng tính Thể hiện tính acid trong môi trường kiềm Thể kiện tính kiềm trong môi trường acid II-Tính chất của protein 3.Tính hòa tan Khả năng hòa tan của protein trong nước Khả năng hòa tan của protein trong dung môi Các yếu tố ảnh hưởng đến tính tan Nồng độ muối của dung dịch Nhiệt độ Bản chất và cấu hình protein pH của dung dịch Loại dung môi Các quá trình định tính + định lượng protein và acid amin Dụng cụ Cốc có mỏ Bình nón Bếp điện lót lưới amian Bình định mức Pippet có bầu và pippet thường Burret III-Các phương pháp định tính acid amin 1. Phản ứng tạo phức với kim loại nặng Phản ứng này dùng để nhận biết sự hiện diện của acid amin và được thực hiện khi đun sôi 2. Phản Ứng Ninhydrin Phản ứng này dùng để nhận biết các acid amin do tất cả các acid amin đều phản ứng với ninhydrin tạo thành hợp chất màu xanh tím Aminodixetohidrinden Hợp chất màu xanh tím III-Các phương pháp định tính acid amin 2. Phản ứng ninhydrin Riêng prolin khi tạo phức chất với nynhidrin tạo dung dịch màu vàng Đây là phản ứng nhận biết prolin Hình 8 : dung dịch màu vàng III-Các phương pháp định tính acid amin 3. Phản ứng Xantoprotein Phản ứng để nhận biết các acid amin trong các protein mạch vòng Khi đun nóng protein với HNO3 đậm đặc tạo thành dẫn xuất nitơ màu vàng Dinitrotyrozin (màu vàng) III-Các phương pháp định tính acid amin 3. Phản ứng Xantoprotein Khi thêm dung dịch kiềm sẽ tạo Quinoit màu cam, ngược lại protein không chứa mạch vòng không sinh phản ứng Dinitrotyrozin (màu cam) III-Các phương pháp định tính acid amin 4. Phản ứng Millon ( nhận biết tyrozin) Khi thuốc thử millon tác dụng với vòng phenol có trong tyrozin sẽ tạo thành hợp chất notrotyrozin có màu đỏ Nitrotyrozin (màu đỏ) III-Các phương pháp định tính acid amin 5. Phản ứng Adamkievic ( nhận biết Tryptophan) Trong môi trường acid, tryptophan phản ứng với các aldehuyt tạo màu đỏ tím đặc trưng Bis – 2-tryptophanalilmetan III-Các phương pháp định tính acid amin 6. Phản ứng sakagichi ( nhận biết arginin ) Khi arginin tác dụng với NaBrO và -naphton sẽ tạo sản phẩm màu đỏ cam Naphtoquinoimin (màu đỏ cam ) III-Các phương pháp định tính acid amin Phương pháp formol Cách tiến hành: cho vào erlen- 20ml dung dịch amino acid- Dd NaOH 0,1N  xuất hiện kết tủa màu vàng nhạt- Thêm 20ml dd formol 30% đã trung hòa sau 5 phút dd mất màu- Chuẩn độ bằng NaOH đến khi màu vàng xuất hiện trở lại IV-Các phương pháp định lượng acid amin Phương pháp formol Tính kết quả:- 1ml dd NaOH tương đương với 1,4mg nitơ – Số mg nitơ của dung dịch được tính theo công thức N = (A – B) x 1,4 (mg) Trong đó – A : số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ bình thí nghiệm – B : số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ bình kiểm tra IV-Các phương pháp định lượng acid amin V-Các phương pháp định tính protein 1. Phương pháp Biure- Đây là phản ứng đặc trưng của liên kết peptide (CO-NH-) – Trong môi trường kiềm, các hợp chất có chứa từ hai liên kết peptide trở lên có thể phản ứng với CuSO4 tạo thành phức chất màu xanh tím, tím, tím đỏ hay đỏ.- Cường độ màu thay đổi tùy thuộc vào độ dài mạch peptide 1. Phương pháp Biure Cách tiến hành – ống nghiệm 1: cho vào 1 ít Biure và 1ml NaOH 10% và 1-2 giọt CuSO4 1%- ống nghiệm 2 : cho vào 3ml lòng trắng trứng gà 1% và 1ml NaOH 10% và 1-2 giọt CuSO4 1% Kết quả- ống 1: Dung dịch tím đỏ – ống 2: Dung dịch màu tím V-Các phương pháp định tính protein 2. Kết tủa thuận nghịch bằng muối trung tính – Các muối của kim loại kiềm và kiềm thổ (thường dùng là (NH4)2SO4 , Na2SO4, NaCl, MgSO4­) gây kết tủa thuận nghịch protein. Sau đó nếu loại bỏ nhanh các yếu tố gây kết tủa ,protein trở về trạng thái dung dịch keo bền. – Các protein khác nhau có thể bị kết tủa với các nồng độ muối khác nhau. V-Các phương pháp định tính protein 2. Kết tủa thuận nghịch bằng muối trung tính Cách tiến hành – ống nghiệm 1: kết tủa globulin+ 3ml nước cất – ống nghiệm 2 : kết tủa albumin+ 3ml nước cất Kết quả- ống 1: kết tủa tan từ từ trong nước cất .- ống 2: kết tủa tan ngay trong nước cất. V-Các phương pháp định tính protein VI-Các phương pháp định lượng protein Phương pháp xác định đạm formol Cách tiến hành Lấy 2 erlen và đánh dấu bình 1 và 2- Bình 1 :dùng kiểm tra,- Cho 50ml dd formol ½- 3 giọt phenolphtalein 3% – Dùng dd NaOH 0,1N để hiệu chỉnh màu trong bình cho đến khi chỉ còn màu hồng nhạt- Ta được formon ½ trung hòa Phương pháp xác định đạm formol Cách tiến hành – Bình 2 :Dùng làm bình thí nghiệm. – 10ml dịch mẫu (pha loãng từ 5 đến 20 lần )- 10ml dd formol ½ đã trung hoà – 3 giọt phenolphtalein 3%- Sau đó chuẩn độ bằng dd NaOH 0,1N cho đến khi dd trong bình 2 có màu hồng (đậm hơn màu ở bình 1) VI-Các phương pháp định lượng protein Phương pháp xác định đạm formol Cách tiến hành thực hiện chuẩn độ 3 lần thật và 3 lần với nước cất VI-Các phương pháp định lượng protein Phương pháp xác định đạm formol Tính kết quả M(g/l) = 1,4 ( V2 – V1 )/a Trong đó :- V1 là thể tích NaOH 0,1N trung bình của 3 lần thử không- V2 là thể tích NaOH 0,1N trung bình của 3 lần thử thật- a là lượng mẫu (ml) ứng với 10ml dịch mẫu pha loãng x lần (a= 1 ml = 0,001 l).  M(g/l) = 1,4 (0,0 106 – 0,00045 )/0.001 = 14,21 VI-Các phương pháp định lượng protein 2. Phương pháp KJELDAHL Cách tiến hành – Hút 1ml (lỏng) hoặc cân 1g (rắn đã nghiền nhuyễn) cho vào bình Kjendanl ,cho thêm 10ml H2SO4 đậm đặc cho thêm 0,5g hỗn hợp K2SO4 : CuSO4 : Se (100:10 :1) làm xúc tác, đun nhẹ cho hỗn hợp mất màu, đun mạnh khi dd hoàn toàn hóa lỏng, lắc nhẹ và đun tới khi dd hoàn toàn trắng VI-Các phương pháp định lượng protein 2. Phương pháp KJELDAHL Cách tiến hành – Chuyển toàn bộ dd đã vô cơ hóa sang bình định mức 100ml ,thêm nước cất cho đến ngấn chia,lắc đều – Lấy vào bình tam giác 10ml H2SO4 0,1N ,thêm vài giọt chỉ thị phenolphthalein và lắp vào máy cất như mô hình VI-Các phương pháp định lượng protein 2. Phương pháp KJELDAHL Cách tiến hành Hình 9: Mô hình p.p KJELDAHL VI-Các phương pháp định lượng protein 2. Phương pháp KJELDAHL Cách tiến hành – Đun sôi nước trong bình cầu tạo hơi nước ,mở nước vào ống sinh hàn .Sau đó qua phễu cho vào bình cất 10ml dd thí nghiệm từ bình định mức và tiếp đó 8-10ml dung dịch NaOH 40% .Tráng phễu bằng một lượng nhỏ nước cất .Hơi nước từ bình cầu sục qua bình phản ứng và kéo theo NH3 sang bình hấp phụ . Quá trình cất kết thúc sau 15 phút .Định phân lượng H2SO4 dư bằng dung dịch NaOH 0,1N. VI-Các phương pháp định lượng protein 2. Phương pháp KJELDAHL Tính toán kết quả. – Hàm lượng nitơ được tính theo công thức Trong đó :- X: hàm lượng nitơ (g/l)- a: số mol H2SO4 0,1N đem hấp thụ NH3- b: số mol NaOH 0,1N tiêu chuẩn tiêu tốn cho chuẩn độ- V: số ml phẩm vật đem vô cơ hóa- 0,0014: lượng g nitơ ứng với 1ml H2SO4 0,1N VI-Các phương pháp định lượng protein Nồng độ chất chuẩn độ không đảm bảo chính xác Cân mẫu và lấy mẫu không chính xác Nước bị ô nhiễm các ion Thiết bị dùng để chuẩn độ không sạch và không thật khô VII-Những yếu tố ảnh hưởng đến kết quả phân tích VIII-Kết luận ứng dụng của quá trình định tính và định lượng trong thực tế rất rộng rãi Phân tích hàm lượng đạm trong nước mắm, thịt bò, nước tương… Phân tích hàm lượng đạm trong sữa, phomat Xác định nồng độ của NaOH trong quá trình sản xuất bột ngọt Phân tích hàm lượng ion sắt có trong nước giếng IX-Tài liệu tham khảo. chúng tôi Sansangdethanhcong.com chúng tôi

--- Bài cũ hơn ---